作为〈2015灵芝研发与应用学术研讨会〉第一位演讲者，许瑞祥教授把重心聚焦在小孢子灵芝免疫调节蛋白 GMI 的发现、研发、量产与应用。预计2016年即将有 GMI 的保健食品在美国正式上市，这将是第一个成功商品化且打入国际市场的灵芝单一活性成分，而「可以量产」则是此活性蛋白比灵芝多醣和三萜提早达阵的关键因素。
主讲／许瑞祥 整理／吴亭瑶
作为〈2015灵芝研发与应用学术研讨会〉第一位演讲者，台大许瑞祥教授把重心聚焦在小孢子灵芝免疫调节蛋白 GMI 的发现、研发、量产与应用，不仅紧扣此次灵芝研讨会「研发」与「应用」两大主题，更呼应大会主席林志彬教授强调灵芝进军国际的必备条件──安全、有效，质量可控。
诚如许瑞祥所言，「我们研究灵芝这麽久，当然希望灵芝的成分可以改善人类和动物的健康」，2016年即将有诉求抗发炎、抗氧化、调节免疫、调节血糖……的 GMI 保健食品在美国正式上市，这也将是第一个成功商品化且打入国际市场的灵芝单一活性成分，而「可以量产」则是此活性蛋白比灵芝多醣和三萜提早达阵的关键因素。
GMI 的产业化将把灵芝的应用带入另一个新时代，但演讲一开始，研究灵芝栽培与菌种监定起家的许瑞祥还是从最基本的「何谓赤芝」谈起，因为唯有追本溯源把根本弄清楚了、稳固了，展望的未来才会实在。
许瑞祥教授的灵芝研究历程
1981～1989年：以形态分类、生化特性、交配育种研究灵芝，开发、提供生产和研究用的菌株。
1990～1999年：建构灵芝属的分子生物学监定系统（以基因监定灵芝），提供确认物种的平台技术。
2000年迄今：以灵芝特殊基因的开发应用为主，将灵芝里的功能性蛋白单独开发应用。
赤芝不只一种，Ganoderma lucidum 同名异种问题严重
中华人民共和国药典把多孔菌科的赤芝（Ganoderma lucidum）和紫芝（G. sinenese）列为药材。但什麽灵芝是赤芝？赤芝的学名是否为 G. lucidum？这是作为灵芝发源地的中国，不论学术界或产业界，必须深刻思考的问题。
三十年前我刚开始做灵芝研究时，台湾灵芝农场种的都是红色灵芝，他们都说他们种的是赤芝，也就是 G. lucidum，但我怎麽看都觉得那里面的灵芝并非只有一个物种。
於是我花了六年的时间（1984～1990）建立「灵芝分类监定系统」当作我的博士论文（1），经比对某一特定区段的基因序列（限制酶水解基因片段多型性图谱），确定台湾农民常种的红色灵芝其实包含两个种：G. lucidum 和 G. tsugae（松杉灵芝），而这个物种是无法交配的，所以确定是两个完全不同的物种（图一）。
〔图一〕1989 年许瑞祥以人工栽培获得的灵芝（G. lucidum，图左）与松杉灵芝（G. tsugae，图右），
它们无法交配产生下一代，因此确定是两个完全不同的物种。（提供／许瑞祥）
1995 年我们把世界各地收集到的红色灵芝，以基因监定的方式（比对核糖体的基因序列）进行分类，结果发现可以分出很多群（图二），这表示不同国家地区所指称的G. lucidum实际并非同一物，而是包含好几个不同的物种（2）。
为了帮助大家快速确认自己用的是什麽菌种，我们找到了一个功能性基因──超氧歧化酶（SOD）的基因──它带有一个非转译区的序列，可以把灵芝属菌株分得很清楚（图三）（3）。
所以，我相信过去中文文献上所写的「赤芝」至少包含 G. lucidum（灵芝）、G. tsugae（松杉灵芝）、G. capense（薄树芝）、G. boninense（狭长孢灵芝）、G. tenue（密纹薄芝）等栽培种类。在西方文献中所指的「G. lucidum」就更复杂了，可能包括：G. ahmadii、G. boninense、G. lucidum、G. oregonense、G. pfeifferi G. resinaceum、G. tsugae、G. valesiacum……等种，这些物种在不同的国家地区都被用 G. lucidum 当学名。
〔图二〕利用核糖体基因序列分析不同地区红色灵芝的亲缘关系。（提供／许瑞祥）
〔图三〕利用 Mn-SOD 基因序列进行灵芝属菌?类源关系监定之结果。（提供／许瑞祥）
Ganoderma lingzhi 是.......？
最近对於什麽是 G. lucidum 又有一些讨论（图四）。2012年戴玉成、吴声华等提出，两岸常用的 G. lucidum 应该是一个新的物种，叫作 G. lingzhi（4、5）。G. lingzhi 到底指的是什麽？仔细看他们发表的论文会发现，他改成 G. lingzhi 的第一支菌株，就是 1994 年我做基因监定的松杉灵芝。
在此要说明的是，我博士论文所指的灵芝和松杉灵芝，是根据当时中国科学院邓叔群先生所监定的 G. lucidum 和徐连旺先生所监定的松杉灵芝，作为分类监定的依据（图五）。所以吴声华等於就是把我监定的松杉灵芝改名为 G. lingzhi 而已。
我个人觉得，如果分类一直改新学名，会让学术界、产业界、产品开发和国际上造成极大的困扰，因为到底你用的是什麽材料，大家会搞不清楚。要用哪个学名来代表大家栽培常用的灵芝，可以再思考，没有定论，但自己栽培的到底是哪个物种的哪个品系，绝对要弄清楚。
〔图四〕资料来源／截取自《自由时报》网站 2012 年 7 月 6 日〈生活版〉新闻
〔图五〕图左为时中国科学院邓叔群先生所监定的灵芝（G. lucidum），
图右为徐连旺先生所监定的松杉灵芝（G. tsugae）。（提供／许瑞祥）
灵芝免疫调节蛋白的发现
灵芝的有效成分，包括多糖、三萜、腺苷等，从 1971 年开始陆续被发现。1989 年日本学者 Kino 在灵芝菌丝体里找到一个活性蛋白叫 LZ-8。
当初发现 LZ-8 时就知道它可以促进淋巴细胞分裂、抑制某些过敏反应、改善第二型糖尿病等等。有趣的是 LZ-8 会凝集羊的红血球，但不会凝集人的红血球，代表它可能可以在人体内发挥一些作用。
这类蛋白因为具有调节免疫的作用，所以现在都被统称为 fungal immunomodulatory protein（真菌免疫调节蛋白，简称 FIP）。这类蛋白并非只存在於灵芝（G. lucidum），金针菇、草菇、松杉灵芝、日本灵芝（G. japonicum）、小孢子灵芝（G. microsporum）、紫芝（G. sinense）等许多物种都有这类蛋白。最新文献甚至指出（6），连子囊菌纲的真菌都可找到类似的蛋白，表示在所有真菌家族演化的过程当中，都有这类蛋白存在。
正因为它是蛋白，可以透过基因转译大量生产，因此能比多醣和三萜更快被产业化应用。我接下来要报告的，就是这个蛋白被产业化应用的具体结果。
灵芝免疫调节蛋白的相关专利
一个成分能否被产业化应用，除了看它的科学文献之外，还要看它的相关专利。我把这类蛋白的专利分成四个部分，第一部分是有关 LZ-8 的序列调整、更改，以及建构这类蛋白大量生产的表达系统，上海交通大学在这方面有一系列的专利。
第二个部分是吉林大学医学院申请的专利，主要在做这类蛋白的分离、纯化和功能（包括诱发癌细胞凋亡、减少缺血性损伤、治疗血小板减少症），从专利内容和这些专利是与几家产业公司合作申请的，可以看出他们正针对某个特定主题为 LZ-8 的产业开发做准备。
第三部分是由台湾的台北医学大学把 LZ-8 拿来做促进伤口癒合的专利。更早之前，还有台湾业者这个蛋白应用於免疫调节、改善第二型糖尿病、降低器官移植排斥效应等。
第四部分要和大家详述的专利是 GMI（小孢子灵芝免疫调节蛋白），也是今天我报告的重点，它在抑制癌干细胞和促进神经细胞生长方面的专利已在申请中。
GMI 的发现与量产
GMI 是从小孢子灵芝（图六）拿到的一段免疫调节蛋白基因，它的基因序列和 LZ-8 类似，但又不完全一様。当时为了避开 LZ-8 被日本学者专利的基因部位，我将手上众多的灵芝菌种以 genome walking 的方法进行基因选殖，发现有某些物种的基因序列和 LZ-8 不一様，而 GMI 就是其中之一。
把它送到嗜甲醇酵母菌进行表达，结果发现，表达出来的蛋白，不论分子量或基因序列，都和原本的 GMI 完全一様。随後再把这个蛋白纯化做成结晶，可以看出它是由四个单体组合而成（图七），和 LZ-8、金针菇免疫调节蛋白（FIP-fve）的立体构造非常相似，但仍有些微差异（图八），而这些差异正是造成它们功能上有所不同的原因。（7）
1989 年由〔图六〕许瑞祥所命名的新种灵芝──小孢子灵芝（G. microsporum）。（提供／许瑞祥）
〔图七〕来自小孢子灵芝的 GMI 蛋白是由四个单体组合而成。（提供／许瑞祥）
〔图八〕GMI、LZ-8、金针菇的免疫调节蛋白（FIP-fve）的结晶有「大同小异」的立体结构，
这些些微差异，正是造成它们在功能上有不同表现的关键因素。（提供／许瑞祥）
为了验证这个成分能否被产业化，我们开始建构生产技术来生产这个蛋白。以酵母菌 Pichia pastoris 液态发酵生产 GMI 为例，已经完成 5,000 公升发酵槽的生产配方与产程调控技术，每公升培养液可回收、纯化重组蛋白达 0.5 公克以上。
目前这个蛋白在发酵槽生产後，经过回收、浓缩、纯化，可以做出 95% 以上纯度和 75% 以上纯度的蛋白。未来如果当作蛋白药物使用，可以用前者来做；当作食品用後者来做即可。
GMI 有多种功能性，口服就有效
当你可以大量表现这个蛋白时，就能给很多科研单位做功能性实验。目前为止，GMI 在细胞与动物实验被证实，在相对低剂量下（5 ug/ml）具有刺激人类 T 细胞株分泌 IL-2、降低发炎因子分泌、抑制 NF-κB 转录活性、抑制肿瘤生长和转移，以及诱发肿瘤细胞凋亡等能力，显示其可用於调节免疫、调节血糖、抗癌与辅助抗癌等蛋白质药物的开发。动物实验也证实，GMI 可以促进离乳小猪的存活率达到 100%。此外，GMI 还可促进神经细胞再生。
● 美国 NIH 证实 GMI 对多种癌细胞有效
这个蛋白要产业化，必须经过第三方公正单位的评估，因此我们委托美国 NIH（National Institutes of Health，国立卫生研究院，是美国联邦政府中首要的生物医学研究部门）以 9 种不同的癌，共计 60 个癌细胞株，对 GMI 进行实验。
实验结果详见下图，往上的长条图代表它有杀死癌细胞的能力，往下的长条图代表它有抑制癌细胞生长的能力，这说明了 GMI 对於美国人常见的癌症，包括：血癌、非小细胞肺癌、大肠癌、中枢神经癌、黑色素瘤、卵巢癌、肾脏癌、前列腺（摄护腺）癌，以及乳癌，都有不同程度的抑制或杀癌细胞的能力（图九）。
〔图九〕美国 NIH 证实 GMI 对美国人常见的 9 种癌症有抑制作用。
（提供／许瑞祥。点选图片可放大）
● GMI 的有效剂量很低
我们也与不同的学术单位合作，对GMI抑制非小细胞肺癌、乳癌、口腔癌等细胞株的作用进行实验。值得注意的是，它的剂量单位是 micromolar（μM），换算成重量就是microgram（μg），千分之 mg，代表它很容易达到有效剂量。
动物实验即证实，以口服方式喂食非小细胞肺癌的动物 GMI，每公斤体重喂食 18～16 mg 就能产生抗肿瘤作用，这个浓度比起灵芝其他有效成分相对低很多。
● GMI 抑制非小细胞肺癌
2011 年我在北京举办的〈国际灵芝研究学术会议〉报告时，曾放了这张投影片（图十），这是当时 GMI 最新的报告（8），喂食接种非小细胞肺癌的小鼠，比较有用和没有用 GMI 的肿瘤大小，证实口服 GMI 确实是有效的。至於这个蛋白质为什麽口服有效，目前还不清楚。
〔图十〕灵芝GMI对小鼠的非小细胞肺癌肿瘤，有显着的抑制作用。
（资料来源／Autophagy, 2011; 7(8): 873-882.）
● GMI 抑制口腔癌干细胞
GMI 不只对一般的细胞株有效，对癌干细胞（cancer stem cell）也有效。癌干细胞是癌细胞分化前的母细胞，治疗癌症时，如果癌干细胞没被清除掉，很容易使得原本好转的病情再度恶化而出现扩散和转移，因此医学界希望能用标靶的方式找到癌干细胞，进而抑制它或杀掉它。
而根据我们的细胞实验，不同浓度的GMI可以对这些带有特殊分子标记的癌干细胞产生抑制作用；动物实验也证实，每天给小鼠吃 150 μg 的 GMI，可明显抑制口腔癌干细胞的生长，此结果再次说明这是一个口服有效的蛋白。
● GMI 有抗氧化作用
另外我们也发现，这个在细胞外没有抗氧化能力的蛋白，在细胞内可增强维生素C的抗氧化能力。
● GMI 促进神经细胞再生
至於 GMI 对神经细胞再生的作用，我们做了两个实验，一个是前处理（先给 GMI再伤害神经细胞），另一个则是同时处理（给 GMI 和伤害神经细胞同时进行）。结果发现，年轻的神经细胞，不管是前处理或同时，都会看到 GMI 有明显的促进再生作用；对老的神经细胞，同时处理是没效的，必须前处理才有效。这表示经常吃这个蛋白，神经受损比较容易恢复。
● GMI 对脑中风的保护作用
这是一个大鼠的中风模式，把 GMI 从静脉注射进去之後，在 3.3 μg/kg 的剂量下，从脑部切片可发现，有注射 GMI 者，比没注射 GMI 者，所受到的脑部氧化伤害要少很多。
GMI有食品等级的安全性
以上介绍的是 GMI 的药用用途，接下要和大家报告 GMI 作为食品添加物和保健食品的用途，相信 GMI 在这方面的应用可以让它的开发更宽广。作为一个食品的首要条件是它的安全性，我要再次强调，一个成分一定要先求安全、再求确效，最後才是量产。
根据GMI的安全性报告，在急毒性与亚慢毒性的动物毒理实验条件下，以 150 mg/kg 剂量的 GMI 连续 14 天，以及 100 mg/kg 剂量的 GMI 连续 90 天喂食大鼠，并未发现任何不良反应，显示它具有食品等级的安全性。
在如此高度安全和功能的条件下和，GMI 已取得美国食品药品管理局（US FDA）新饍食成份上市前通知（New Dietary Ingredient Notification），预计从2016年开始就会有 GMI 产品在美国贩售，而产品的保健诉求将涵括抗发炎、抗氧化、免疫调节、调节血糖等功效。
GMI可以提高动物的抵抗力、存活率、饲料换肉率
除了药品、保健食品，动物保健食品市场也是我们关注的另一个焦点。把 GMI 用在宠物身上，可以对 O-157 出血性大肠杆菌引起的急性肠道发炎，发挥抑制发炎、保护肠黏膜的作用，此结果让我们相信它可以被开发成饲料添加物。
动物实验也证实，把这个蛋白以 20 μg/kg 的剂量添加到饲料里，可以增加饲料换肉率，提高保育猪的存活率，减少抗生素的使用，提高疫苗的效价。以下这张图，左边是吃了 40 天 GMI 的母猪，右边是和母猪同个时候出生的公猪，但没有吃 GMI。自然界的动物通常是公的体积比母的大，但原本同様大小的小猪，40 天後母猪竟长得比公猪大（图十一），明显可以看出有无喂食 GMI 的差别。
〔图十一〕有吃 GMI 的母猪（图左）长得比同龄的公猪（图右，未吃 GMI）大，
显示 GMI 能提高饲料换肉率。（提供／许瑞祥）
GMI可以量产，极具市场竞争力
总结来说，这个蛋白目前因为可以量产，而且功效明确、安全性高，将来在食品、药品、美容保养品、动物饲料等的应用上，都可直接产业化和商品化。我们研究灵芝这麽久，当然希望灵芝的成分可以改善人类和动物的健康。多醣和三萜要萃取，可能它的价格会是一个门槛，而这个蛋白可以大量被表现，因此它的价格应该会极具市场竞争力。
延伸阅读
1. 灵芝在生技领域研发的新趋势
2. 真菌种源监定先驱，台湾大学生化科技学系许瑞祥教授稳固菇蕈产业根基
参考文献
1. 许瑞祥，1990，灵芝属菌株监定系统之研究，国立台湾大学农业化学所博士论文。
2. Moncalvo JM, et al. 1995. Rhylogenetic relationships in Ganoderma inferred from the internal transcribed spacers and 25S ribosomal DNA sequences. Mycologia, 87: 223-238.
3. 王惠芳，1996，灵芝属含锰超氧歧化酶基因之研究，国立台湾大学农业化学研究所硕士论文。
4. Cao Y, Wu SH, Dai YC. 2012. Species clarification of the prize medicinal Ganoderma mushroom “Lingzhi”. Fungal Diversity, 56:49-62
5. 戴玉成等，2013，中国灵芝学名之管见，菌物学报，138(06) : 947-952.
6. Bastiaan-Net S,et al. 2013. Biochemical and functional characterization of recombinant fungal immunomodulatory proteins (rFIPs). Int Immunopharmacol. 15:167-175.
7. Wu MY, et al. 2007. A 2.0 ? Structure of the Fungal Immunomodulatory Protein GMI from Ganoderma microsporum. 台湾大学生化科技学系会议论文。
8. Hsin IL, et al. 2011. GMI, an immunomodulatory protein from Ganoderma microsporum, inducesautophagy in non-small cell lungcancer cells. Autophagy 7:8, 873-882.
