本实验室在不同的灵芝属菌株中发现，许多相异於LZ-8的灵芝免疫调节蛋白质，这意谓着未来将有LZ-9、LZ-10……等许多灵芝免疫调节蛋白质的出现，而且它们的生理功能甚至可能更优於LZ-8！
文／许瑞祥
◎本文原载於2004年10月《健康灵芝》第26期 20~26页
本实验室在不同的灵芝属菌株中发现，许多相异於LZ-8的灵芝免疫调节蛋白质，
这些蛋白的生理功能可能更优於LZ-8！（提供／许瑞祥）
由日本人发现的 LZ-8 已被证实具有抑制自体免疫性第一型糖尿病之发生、延缓异体移植所产生的排斥效应，以及调整过敏体质等多种免疫调节的生理活性。其构造与人类免疫球蛋白相似，对人类红血球也不发生任何凝集反应，很适合应用在医疗用途上。
虽然 LZ-8 之部分胺基酸序列已经被多国专利所保护，然而台湾大学微生物暨生物化学研究所却在不同的灵芝属菌株中发现，许多相异於 LZ-8 的灵芝免疫调节蛋白质，在这两段受专利保护的区间里胺基酸序列仍有所差异。
这不啻意味着未来将有 LZ-9、LZ-10……等等许多灵芝免疫调节蛋白质的出现，其生理功能甚至可能更优於目前已经被专利的 LZ-8！
何谓灵芝？
灵芝自古以来为我国吉祥如意的象徵，同时亦是滋补强壮、扶正固本的珍贵药材。根据中国着名药学典籍《神农本草经》的记载，灵芝被列为「上品」，意指养生之药，长期服用可调整体质且无副作用。
1970 年代中国所发表的临床报告指出，灵芝制剂对於慢性支气管炎、哮喘、冠心病、心绞痛、高脂血症、神经衰弱、肝炎、白血球减少症等有很好的疗效。此结果证实了古籍所述对灵芝的药用价值，也引发现代医药学界对灵芝化学组成及药理研究的高度兴趣。
经过三十年的药理研究结果确认，灵芝的萃取物中具有镇静、镇痛、镇咳、强心、保肝、降血压、降血脂、降血糖、降胆固醇、抗过敏、抗发炎、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化与免疫调节功能等活性成分，而广受各国研究人员的重视，成为延迟老化、预防慢性疾病的寄托。
灵芝是属於真菌界（Myceteae）、无鞭毛菌门（Amastigomycota）、担子菌纲（Basidiomycetes）、无蕈褶目（Aphyllophorales）、多孔菌科（Polyporaceae）中的灵芝属（Ganoderma），而灵芝属的主要特徵在於具有双层细胞壁的担孢子。
目前灵芝属在文献中虽然有 200 种左右，但在药理和临床的研究中只有灵芝（Ganoderma lucidum）、松杉灵芝（G. tsugae）、薄树灵芝（G. capense）、狭长孢灵芝（G. boninense）、无柄灵芝（G. resinaceum）等红色的灵芝和中国紫芝（G. sinense）、新日本灵芝（G. neo-japonicum）等紫色灵芝，以及树舌灵芝（G. applanatum）等少数特定的灵芝被研究与利用。
灵芝的药理研究与成分发现
在灵芝的药理研究中，抗癌活性是最早被发现的。其中，灵芝多糖体被认为是抗癌活性的主要成分，其他尚有三萜类和小分子蛋白质等活性物质。
（一）灵芝多糖
1971 年 Sasaki 等人发表树舌灵芝（G. applanatum）的多糖体具抗肿瘤活性，使得多糖体成为灵芝第一项被证实的活性成分（Sasaki, 1971）。目前已经了解其作用机制并非直接杀死或抑制癌细胞，而是经由提高免疫力来间接表现其抗癌活性：活化 T 细胞，并增强自然杀手细胞的能力（Lei and Lin, 1991）。
此外，对於单核的巨噬细胞亦可增强其吞噬能力，并促进抑制肿瘤生长的细胞激素，如介白素（IL-2、IL-4）、干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子（TNF-α）等的合成与释放（Lieu et al., 1992）。经由强化自然杀手细胞和巨噬细胞，直接攻击不正常的肿瘤细胞，达到防癌、抗癌之效果。
这种藉由提供生理讯号来启动原本具有的能力，相当符合传统中国医学所谓「扶正固本」的观念。此作用亦类似於西方医学所谓「生物反应修饰剂」（biological response modifier, BRM）的概念，经由增强或调节机体的免疫功能，减轻致病因素对人体的伤害，进而提高人体抗病能力，达到治病、防病的目的（Mizuno et al, 1995）。
（二）灵芝三萜类化合物
除了多糖体外，1982年 Kubota 等从灵芝（G. lucidum）的子实体中萃取出特殊的三萜类化合物，命名为灵芝酸 A、B（ganoderic acid A、B），迄今至少有 119 种新的三萜类化合物自灵芝的子实体、菌丝体和担孢子中被发现。
这些三萜类除了构成灵芝属苦味的成分外，目前所知其药理研究结果包括：毒杀癌细胞株、抗 HIV 病毒、抗氧化、抗过敏、抗高血压、保肝等作用（Kim and Kim, 1999）。
（三）免疫调节蛋白质的开发
灵芝的另一种活性物质，免疫调节蛋白质，於 1989 年由日本学者 Kino 等人自 G. lucidum 菌丝体中分离出来，命名为 LZ-8（Ling Zhi-8）。LZ-8 由 110 个胺基酸所组成（图一），分子量为 12,420Da，其构造与人类免疫球蛋白重链区之可变区域的胺基酸序列及二级结构有某程度的相似性（Tanaka, 1989）。
图（一）LZ-8 之胺基酸序列与二级结构图（Lin, 1997）。（提供／许瑞祥）
原态的 LZ-8 是以同源双体（homodimmer）的形式存在，具有促进淋巴球增殖、抑制系统性过敏反应（systemic anaphylaxis reaction）和局部过敏反应（arthus reaction）的作用。此外，LZ-8 对於绵羊红血球会产生凝集作用，对人类红血球却不发生任何凝集反应（Kino, 1989），这显示 LZ-8 在人类医药用途上有其开发应用之潜力。
LZ-8 与外源凝集素（lectin）一样，具有凝集细胞和促进淋巴球增殖的能力。由於外源凝集素对醣类具有专一性结合的能力，故又称「亲醣蛋白」。这种对醣类专一性结合的特性，使其具有结合细胞表面特定醣基，进而刺激细胞引发後续免疫反应之能力。
在 LZ-8 被发表的同时，支持研究 LZ-8 的日本明治集团同时在日本、欧洲和美国申请专利。日本方面分别於 1990 年（JP2032026）、1991 年（JP3172184）和 1993 年（JP5068561）通过 LZ-8 作为抗爱滋药剂与核酸序列之专利。欧洲和美国则於 1994 年（EP0288959B1、US5334704）通过 LZ-8 蛋白质特性和作为免疫抑制药剂之专利。
除此之外，欧美的专利内容还针对 LZ-8 部分序列加以保护：只要有任一醣蛋白之蛋白质序列中同时具有 -Leu-Ala-Trp-Asp-Val-Lys- 和 -Asn-Leu-Gly-Val-Lys-Pro-Ser-Tyr-Ala-Val- 等胺基酸组成，便侵犯到LZ-8的专利范围。因此，其他各国对灵芝免疫调节蛋白有兴趣的研究人员只好转移研究对象，尝试从各种菇类中搜寻是否有类似的蛋白质存在，如金针菇（Ko, 1995）与草菇（Hsu, 1997）。
免疫调节蛋白质的药理研究进展
（一）有效抑制糖尿病及延缓异体移植排斥效应
自 1989 年 Kino 发现 LZ-8 可刺激鼠科脾脏细胞增殖，以及避免局部性和系统性过敏反应，後续更有研究指出 LZ-8 可以有效抑制非肥胖型糖尿病鼠（Nonobese diabetic, NOD）的自体免疫性第一型糖尿病之发生（Kino, 1990）。此外，LZ-8 在胰脏异体移植方面可以显着延缓发生排斥的时间。
相较於其他免疫调节药物（immunomodulatory drug），如 CsA（cyclosporin A，来自真菌具有免疫抑制作用的胜肽）和 FK506（tacrolimus，由土壤真菌所分泌具有免疫抑制作用的抗生素）对於胰脏皆有毒害的危险，但 LZ-8 对於胰岛则没有发现有任何毒害作用（ven der Hem, 1995）。以上结果皆显示 LZ-8 可成为极具潜力的免疫调节药物。
LZ-8 不论在活体外或是活体内的实验，都显现出其免疫调节活性，但其确切作用机制却仍旧不明朗。Kino 等於 1991年发现LZ-8可抑制老鼠抗体的产生，推测 LZ-8 乃藉由阻断抗体的产生而达到抑制系统性及局部性过敏反应（Kino, 1991）。此後，更发现 LZ-8 是透过调控细胞表面附着的分子来达到调节细胞间的交互作用（Miyasaka, 1992），而此交互作用正是自体免疫疾病患者所缺乏。
（二）探讨免疫调节蛋白质作用机制
自 LZ-8 序列发表後，台大医学院生化所也成功自松杉灵芝（G. tsugae）菌丝体中纯化出分子量约13 kD的免疫调节蛋白，命名为 FIP-gts（Fungal immunomodulatory protein-gts）。经胺基酸序列分析，发现其序列与LZ-8完全相同。
LZ-8 不但可以促进人类周边淋巴球细胞（Human peripheral lymphocytes）和小鼠脾脏细胞增生，由细胞摄入 3H-thymidine 之量对蛋白质浓度作图，可得一钟形图：在浓度为 5 μg/ml 时，对人类周边淋巴球细胞可达最高之增殖作用。利用 RT-PCR 方法也证实 LZ-8 可促进细胞激素，如介白素（IL-2、IL-4）、干扰素（IFN-γ）和肿瘤坏死因子（TNF-α）之表现。
除此之外，在一些非灵芝属的菇类中也可纯化出分子量约 13 kD 的免疫调节蛋白，例如：金针菇的 FIP-fve（Ko, 1995）和草菇的 FIP-vvo（Hsu, 1997）。经胺基酸序列分析结果显示，LZ-8、FIP-fve 和 FIP-vvo共有 51 个相同胺基酸（图二），且均含有与人类免疫球蛋白重链的可变区域相当之相似性。因此可推论由灵芝、金针菇和草菇所纯化出之免疫调节蛋白质，在演化上可能都是来自同一起源。
图（二）松杉灵芝、金针菇及草菇纯化所得免疫调节蛋白质
（FIP-gts、FIP-fve、FIP-vvo）三者胺基酸序列之比较（Lin, 1997）。
（提供／许瑞祥）
为进一步探讨免疫调节蛋白质的作用机制，将 LZ-8 利用遗传工程技术，藉由大肠杆菌细胞大量表现，并配合分子生物之删除突变及定点突变技术，可以得到许多不同的突变蛋白质，用以探讨其他生理活性与此蛋白质之活性区位及作用机制。
由实验结果显示，若将胺基端删除 13 个胺基酸，突变蛋白质除了丧失形成同源双体和凝集细胞之能力外，同时也无法促进细胞激素如介白素（IL-2、IL-4）、干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子（TNF-α）之分泌（Lin, 1997）。
综合上述结果证实，免疫调节蛋白（LZ-8）是藉由胺基端的胺基酸形成双体构形结合到淋巴球 T 细胞上，造成细胞凝集，使得 T 细胞活化而启动一连串之讯息传递，并促进各种细胞激素的分泌来达成免疫调节之功能。
（三）调整过敏体质
近年来台湾卫生环境较过去进步许多，但是过敏性患者却日益增多，目前较合理的解释是「卫生假说（hygiene hypothesis）」，也就是「在越清洁的环境中，幼年时期受到的感染越少，则可能导致过敏性疾病罹患率的增加」（Zuany-Amorim et al., 2002）。以免疫学理论而言，是由两种表现不同细胞激素的功能性 T 细胞（T helper 1, T helper 2）之间的平衡关系来解释。
目前认为，早期的细菌或病毒感染会使体内的免疫系统偏向增强 Th1 细胞，进而抵销 Th2 细胞的过敏反应；反之，若细菌感染的机会降低，则造成体内的 Th1 反应较弱，而产生过度的 Th2 反应，以致於过敏反应的增加（Yazdanbakhsh et al., 2002）。有监於此，若是能调节体内的免疫反应使其偏向於 Th1，或许能够治疗甚至是预防过敏性疾病的发生。
由先前的研究发现，LZ-8 可促进细胞激素如介白素（IL-2、IL-4）、干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子（TNF-α）之分泌（Lin, 1997; Haak-Frendscho, 1993）。其中，IL-2 和 IFN-γ属於 Th1 细胞产生之细胞激素；IL-4 则隶属 Th2 细胞。
但是更进一步研究发现，随着 FIP-gts 作用时间拉长，IL-4 的产量却逐渐下降，而 IFN-γ 仍维持高含量。显示 FIP-gts 诱导 IL-4 之产生似乎属於较前期且短暂，培养时间一久，取而代之的是细胞间开始大量产生的 IFN-γ。因此 LZ-8 刺激产生的细胞激素应较偏向 Th1 细胞之活化。
LZ-8 具有促进 Th1 细胞产生细胞激素 IFN-γ 大量产生而与 Th2 细胞反应发生拮抗的能力，使其成为调整过敏体质的最有潜力的药物之一。
经中山医学院毒理所实验室研究结果显示，以 LZ-8 喂食尘蟎致敏小鼠两周後发现，可使致敏後小鼠增高之噬硷性白血球比例降回至正常值范围。显示此种灵芝免疫调节蛋白质（LZ-8）的免疫调节功能可以修正体内过度的免疫反应，用於预防或治疗目前罹患率日趋增加的过敏性疾病。
换言之，日後对於具有过敏体质的患者而言，若能长期使用灵芝免疫调节蛋白质（如 LZ-8），应该可以调整过敏体质、调整体内过度的免疫反应，达到治疗的效果；对於一般民众而言，若平日能适量摄取，则可以避免体内的过敏反应过度被刺激，达到预防的效果。
（四）更具疗效之免疫调节蛋白质
为了解其他灵芝属菌种中是否也存在着此类免疫调节蛋白质基因，我们将数十种不同灵芝菌种的基因抽出後，利用聚合扩增技术来筛选是否存在有此免疫调节蛋白质之相似基因。
在将近 50 株不同菌种的灵芝中，均可得到片段大小相同的基因产物，选定其中 10 种菌种进行定序结果（图三），发现共有 4 株菌株具有与 LZ-8 完全相同之胺基酸序列，其余菌株则分别含有 1～9 个不同的胺基酸序列，此结果显示免疫调节蛋白质 LZ-8 是灵芝家族成员的基本配备。
图（三）LZ-8与其他十种灵芝属来源的免疫调节蛋白质
部分胺基酸序列之比较。（提供／许瑞祥）
除此之外，利用相同方法检验其他真菌，如巴西蘑菇、香菇、洋菇、秀珍菇，甚至是酵母菌，同样发现有大小相似的基因产物存在。显示此类免疫调节蛋白质之基因可能是广泛存在於真菌界的物种当中，至於此类基因产物在真菌细胞生理作用中扮演何种角色，则必须再更深入探讨。
LZ-8 之部分胺基酸序列虽然已经被多国专利所保护（-Leu-Ala-Trp-Asp-Val-Lys- 和 -Asn-Leu-Gly-Val-Lys-Pro-Ser-Tyr-Ala-Val-），但是本实验室在不同的灵芝属菌株中发现，许多相异於LZ-8的灵芝免疫调节蛋白质在这两段受专利保护的区间里胺基酸序列仍有所差异。
这不啻意谓着未来将有 LZ-9、LZ-10……等等许多灵芝免疫调节蛋白质的出现，而且这些灵芝免疫调节蛋白的生理功能（抑制自体免疫性第一型糖尿病之发生、延缓异体移植所产生的排斥效应，以及调整过敏体质等），甚至可能更优於目前已经被专利的 LZ-8！
虽然各种灵芝属来源的免疫调节蛋白质其所具有的胺基酸序列相似性很高，但是蛋白质结构往往会因为一、两个关键性胺基酸的突变而发生剧烈改变，导致此蛋白质活性发生变化。因此，其他相异於 LZ-8 的各种灵芝属来源的免疫调节蛋白质，其功效也可能会异於 LZ-8。
为探讨不同灵芝属的免疫调节蛋白质间，其生理活性是否有所不同，本实验室已成功将不同序列的灵芝免疫调节蛋白质基因，大量表现於大肠杆菌、乳酸杆菌、酵母菌和米麴菌中，後续并将进行此重组蛋白质的生理活性测试，期望能从中筛选出更具疗效的免疫调节蛋白质，为台湾的灵芝生技产业提供另外一个舞台。
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