2023年12月18日／台湾大学／Journal of Biomedical Science
文／吴亭瑶
经由肠胃道和呼吸道感染人类的肠病毒（enterovirus，简称EV）有很多种，虽然大部分引发的都是轻症，但仍有少数会造成脑膜炎、脑炎、急性无力肢体麻痹（acute flaccid paralysis）、急性无力脊髓炎（acute flaccid myelitis）等严重的神经系统症状或导致死亡。像是肠病毒A71型（EV-A71，即过去所说的肠病毒71型）和近十年病例激增的D68型（EV-D68）就是造成重症的两大病毒型别，也是科学家在研发肠病毒疫苗时主要的防范对象。
2020年，台湾大学医学院免疫学研究所江伯伦教授、台大医院医学研究部林郁里副研究员等已经证明，灵芝多醣PS-G可大幅提高鼻滴式肠病毒A71型单价疫苗的免疫保护力；2023年底，该团队发表在《Journal of Biomedical Science》（生医科学杂志）的论文则进一步证明，灵芝多醣PS-G亦能增强鼻滴式肠病毒A71型和D68型二价疫苗诱发的黏膜免疫，大幅降低这两种肠病毒对幼鼠的死亡威胁。
「以灵芝多醣PS-G为佐剂的鼻滴式肠病毒二价疫苗」可以用无痛的接种方式，同步提升黏膜免疫和全身性免疫，防止肠病毒A71型和D68型的致命攻击，显然为新一代肠病毒疫苗刻画出理想的蓝图，也为灵芝多醣作为疫苗佐剂的安全性与有效性再添一枚徽章。
肠病毒二价疫苗＋灵芝多醣PS-G
→滴入鼻腔刺激黏膜免疫
本研究的二价疫苗是以灭活（死掉）的肠病毒A71型和D68型作为诱发免疫系统产生抗体的抗原；添加在疫苗中用来刺激免疫反应、提高疫苗效果的佐剂，则是以特定流程提取自灵芝子实体热水萃取物的灵芝多醣PS-G（polysaccharide purified from Ganoderma lucidum）。
PS-G是含有5%蛋白质的β-D-glucan（β葡聚醣），分子量近15万，具有β（1→3）键结主链与β（1→6）键结分支的基本结构，先前已被证实可以加速树突细胞活化（正确辨识和处理病原体）和成熟（正确激发后续的免疫反应），进而通过T细胞提升免疫系统抗感染和抗肿瘤的能力。
接种方式是从鼻孔慢慢滴入12 μL的疫苗滴剂（每个鼻孔各6 μL），内含灭活的肠病毒A71型和D68型各2.5 μg（肠病毒二价疫苗），添加灵芝多醣为佐剂者另外加入10 μg的PS-G（灵芝多醣PS-G＋肠病毒二价疫苗）。每三周接种一剂，总共接种三剂，接种完最後一剂隔两周检测疫苗诱发的免疫力。
实验同时以20 μg的人用佐剂CpG取代PS-G的位置（对照佐剂CpG＋肠病毒二价疫苗组）用来比较PS-G的效果，并设有空疫苗组（有接种动作，但滴入小鼠鼻腔的是生理食盐水），模拟没有疫苗保护的情形。
灵芝多醣PS-G可提升
肠病毒二价疫苗诱发的免疫力
结果发现，在同样实验条件下，比起未添加佐剂，或有CpG佐剂相助的肠病毒二价疫苗，接种「灵芝多醣PS-G＋肠病毒二价疫苗」的小鼠：
● 黏膜——专一性抗体的数量较多：唾液（口腔黏膜）、鼻腔冲洗液和支气管肺泡冲洗液（呼吸道黏膜）、粪便（肠道黏膜）的专一性IgA和IgG抗体数量明显提升，显示黏膜系统筑起的免疫防线抵挡病毒入侵的能力较好（图1）。
● 血清——抗体中和病毒的能力较强：血清里的专一性IgA和IgG抗体数量也明显增加，抗体中和病毒（与病毒结合阻其感染细胞）的能力也比较强，而且对多种基因亚型的肠病毒A71型和D68型有广泛中和作用，显示即使病毒进到体内马上被抗体拦截的机会较高（图2）。
● 脾脏——免疫细胞的反应较快较好：脾脏中负责制造专一性IgA和IgG抗体的细胞（B细胞）较多，脾细胞被肠病毒A71型或D68型刺激後增生的专一性T细胞（专门对付这两种肠病毒的T细胞）和分泌的抗病毒细胞激素IFN-γ（干扰素）、IL-17（介白素17）也明显比较多，显示对於那些入侵得逞的病毒，免疫系统启动後勤支援围剿病毒的效率较高（图3）。
图1 小鼠完整接种疫苗两周後，各部位黏膜对病毒的专一性抗体：添加灵芝多醣PS-G的疫苗效力（红色）明显优於其他组别。（注：本文图表中的*p < 0.05、**p < 0.01和***p < 0.001表示两组相比有显着性差异，p值愈小代表两组差异性愈大，以下两图皆同。）
图2 小鼠完整接种疫苗两周後，血清里病毒专一性抗体的数量和抗体对不同基因亚型肠病毒的中和能力：添加灵芝多醣PS-G的疫苗效力（红色）明显优於其他组别。
图3 小鼠完整接种疫苗两周周後，（A、B）脾脏中抗体生成细胞的数量与（C、D）脾脏细胞被抗原（灭活病毒）诱发T细胞增生与细胞激素分泌的情形：添加灵芝多醣PS-G的疫苗效力（红色）明显优於其他组别。
灵芝多醣PS-G可提高
肠病毒二价疫苗对生命体的保护力
为了确认疫苗诱发的免疫力真能对抗病毒，研究者还做了另一个动物实验，也就是把完整接种「肠病毒二价疫苗」或「灵芝多醣PS-G＋肠病毒二价疫苗」两周後的小鼠血清，从腹腔注射到两天大的幼鼠体内，六小时後再从脑内注入致死剂量的肠病毒D68型或A71型，持续观察十四天。
结果发现，这两种血清都能帮助幼鼠对抗肠病毒D68型和A71型，但接受「接种过灵芝多醣PS-G＋肠病毒二价疫苗的小鼠血清」的幼鼠受到的保护程度更高：不只大脑、脊髓、肌肉等重症相关部位的病毒量明显较少，健康状况也媲美未感染的幼鼠或是能从虚弱的病态中快速康复（而不是恶化成肢体无力或麻痹），存活率更达到百分之百（图4）。
图4 初生幼鼠注射「疫苗小鼠血清」後的抗病毒能力：接受「灵芝多醣PS-G＋肠病毒二价疫苗血清」的幼鼠受到的保护（咖啡色图示）明显优於其他组别：重症率较低、存活率较高、病毒感染量较少。
有灵芝多醣助阵的肠病毒疫苗
免疫力环环相扣，保护力不打折扣
理想上疫苗最好可以同步启动黏膜免疫反应和全身性免疫反应，因为前者可以强化呼吸道、口腔和肠道的黏膜屏障，抵挡病毒入侵；後者可以提高血液循环中的抗体和白血球数量，中和入侵体内的病毒。然而目前绝大多数的疫苗都是肌肉或皮下注射剂型，只能诱发全身性免疫反应；至於透过刺激黏膜（如鼻黏膜）诱发的免疫反应则有不够强大的问题，使得佐剂的选择被视为是突破困境的契机。
现有的（包括台湾在2023年七月获准提供给两个月到六岁孩童自费施打的两支）肠病毒疫苗就都是肌肉注射型，而且只有肠病毒A71型的疫苗，尚无可能在未来变成主流的肠病毒D68型的疫苗。因此在本研究胜出的「以灵芝多醣PS-G为佐剂的鼻滴式肠病毒二价疫苗」，可以用无痛的接种方式，同步提升黏膜免疫和全身性免疫，防止肠病毒A71型和D68型的致命攻击，显然为新一代肠病毒疫苗刻画出理想的蓝图，也为灵芝多醣作为疫苗佐剂的安全性与有效性再添一枚徽章。
佐剂长期以来被用於疫苗中，用来促进免疫反应、减少疫苗剂量和生产成本。尽管至今已经开发许多疫苗佐剂，但经常因为功效有限或副作用而在应用上受到限制，使得开发安全有效的新型疫苗佐剂具有重要意义。
从直接补充广泛调节免疫力，到搭配疫苗精准增强免疫力，来自灵芝子实体的灵芝多醣可说是名符其实的历久弥新、日新又新。且让我们一面期待有灵芝多醣助阵的黏膜疫苗，一面先用手动模式帮助幼小的健康多添一层保护，应对病毒来袭的现在进行式。毕竟不怕一万只怕万一，只有先过眼前关，才有将来可以仰望啊！
〔资料来源〕Yu-Li Lin, et al. A novel mucosal bivalent vaccine of EV-A71/EV-D68 adjuvanted with polysaccharides from Ganoderma lucidum protects mice against EV-A71 and EV-D68 lethal challenge. J Biomed Sci. 2023;30(1):96.
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【附注1】穿透式电子显微镜下的肠病毒A71型和D68型病毒颗粒
肠病毒A71型的病毒颗粒直径约33–35 nm，肠病毒D68型的病毒颗粒直径约30 nm，後者有些病毒颗粒因为缺少单股RNA （病毒自我复制所需的遗传物质）以致看起来像空心的。
（左图／Wikimedia Commons；右图／Viruses. 2018 Jan 30;10(2):58.）
【附注2】急性无力肢体麻痹（AFP）vs. 急性无力脊髓炎（AFM）
急性无力肢体麻痹（Acute Flaccid Paralysis，简称AFP）泛指任何突发性的局部肢体无力，其原因可能来自环境毒素（如神经毒性蛇毒、蜱虫叮咬）、遗传条件和病毒感染；急性无力脊髓炎（也称急性弛缓性脊髓，acute flaccid myelitis，简称AFM）则是一种特殊的AFP，因病毒感染（如肠病毒D68型或A71型）引起脊髓灰质发炎而使身体肌肉和反射变弱所导致，样似小儿麻痹的症状，患者超过九成以上是幼儿，绝大部分在发作前不久会出现轻微的呼吸道症状或发烧。
