2018年11月13日／加勒比中央大学医学院、纽约大学医学院／Oncotarget
文／黄扬哲、李奕柔（台湾大学生化科技学系硕士班一年级）
文章版本一
文／黄扬哲（台湾大学生化科技学系硕士班一年级）
灵芝对抗癌症的功效已经被许多研究证实，大家也都不陌生，不过你可知道灵芝也具有对抗癌干细胞的能力？
众所周知，癌干细胞是形成肿瘤、使肿瘤具有抗药性、转移以及复发的元凶之一，原因在於这群细胞拥有许多干细胞的特性，会表现很多帮浦蛋白，导致许多抗癌药物无法将它们赶尽杀绝，而存活下来的癌干细胞又会长成另一个完整的肿瘤。因此，若是能够有效的杀死这群癌症当中的干细胞，就可大大提高癌症的治疗效果。
美国加勒比中央大学医学院、纽约大学医学院组成的研究团队，成功利用灵芝萃取物来杀死「三阴性乳癌」这种在临床上很难成功治癒的癌症当中的癌症干细胞。
该研究发现，灵芝萃取物不但能降低三阴性乳癌中癌干细胞的存活率、减少癌干细胞的比率，也能在三阴性乳癌小鼠的动物模式中抑制肿瘤生长。进一步分析其作用机制则发现，灵芝萃取物是透过STAT3这条讯息传递路径来抑制肿瘤中的癌干细胞。这项研究成果已被发表於2018年11月的《Oncotarget》期刊。
灵芝萃取物降低三阴性乳癌细胞的存活率
研究者先观查灵芝萃取物GLE对三阴性乳癌细胞株MDA-MB-231的影响，结果发现，随着灵芝萃取物浓度的上升，癌细胞的存活率愈降愈低（如下图）。
灵芝萃取物削弱癌干细胞的特徵
CD24+/CD24-、ALDH1为乳癌干细胞的标记，其他像是OCT4、SOX2、NANOG则为常见的干细胞标记。研究团队发现，经过灵芝萃取物GLE处理後，三阴性乳癌细胞株MDA-MB-231中的许多癌干细胞标记都有变少的趋势（如下图）。换句话说，灵芝萃取物GLE能够降低癌干细胞在整体癌细胞中的比例。
（Vehicle为未使用灵芝萃取物的溶剂对照组）
灵芝萃取物削弱癌干细胞的能力
此外，该团队的研究亦发现，不论是MDA-MB-231或SUM-149哪种三阴性乳癌细胞株，在经过灵芝萃取物GLE处理後，形成球体（mammosphere）的能力明显受到抑制（如下图）。
由於形成球体是乳癌干细胞的才会干的事，一般乳癌细胞并没有这样的能力，因此这个实验结果证明了，灵芝萃取物不只能削弱癌干细胞的表面特徵，还能削弱癌干细胞的实质能力。
灵芝萃取物调控乳癌干细胞的作用机制
由STAT3调控的讯息传递路径与癌干细的发展和恶化息息相关，而根据该团队的研究发现，经灵芝萃取物处理的三阴性乳癌细胞株，STAT3的基因表现明显减少（如下图），其讯息传递路径的活化程度亦大幅下降，此结果暗示这条路径很可能与灵芝萃取物调控三阴性乳癌干细胞的作用机制相关。
灵芝萃取物可抑制三阴性乳癌的肿瘤生长
在三阴性乳癌小鼠的动物实验当中，研究团队也确认利用28mg/kg剂量的灵芝萃取物的确能够有效抑制肿瘤的生长，此结果证实了灵芝萃取物在动物体内的效用。
〔说明〕把三阴性乳癌细胞株MDA-MB-231接种在雌性小鼠的乳腺组织，一周後再以口服方式给予实验小鼠灵芝萃取物，每天剂量28 mg/kg，持续十周。实验结束时溶剂对照组（Vehicle）和灵芝萃取物组（GLE）的肿瘤重量有显着差异。
灵芝萃取物是三阴性乳癌的救星？
尽管研究团队有如此正向的结果，但以灵芝萃取物用来治疗三阴性乳癌可能还有一段路要走，除了还需要更多、更关键的实验证据支持之外，如何将灵芝萃取物中的有效成分分离出来也是将其开发为治疗药物的必须过程，如此才能大大提升灵芝对於乳癌的功效。若能成功达阵，此灵芝萃取物中有效成分「能直捣癌干细胞」的作用，势必能成为治疗三阴性乳癌的利器。
【注1】该研究使用的灵芝萃取物GLE含有萃取自灵芝子实体的多醣（13.%）和三萜（6%），以及1%的灵芝破壁孢子粉。
【注2】上述细胞实验中处理SUM-149、MDA-MB-231的灵芝萃取物GLE剂量分别为0.5 mg/mL和0.96 mg/mL，此为灵芝萃取物GLE造成这两种三阴性乳癌细胞半数死亡的剂量（IC50）。
〔资料来源〕Rios-Fuller TJ, et al. Ganoderma lucidum extract (GLE) impairs breast cancer stem cells by targeting the STAT3 pathway. Oncotarget. 2018 Nov 13; 9 (89) : 35907-35921.
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文章版本二
文／李奕柔（台湾大学生化科技学系硕士班一年级）
乳癌是全球女性癌症死亡的首要原因，估计每年超过45万人死与此疾病。乳癌的临床上分为不同的亚型，如三阴性乳癌（Triple-Negative Breast cancer , TNBC）。TNBC是一种较难治疗的乳癌，占所有乳癌病例的15～20%，主要发生在年轻患者（＜50岁），与其他乳癌相比，确诊治疗後五年的总生存率较低。
迄今为止，TNBC患者的治疗方式为化疗和乳房保留治疗（breast conserving therapy），目前尚没有证明有效的靶向治疗法。TNBC肿瘤如此具有侵袭性的原因之一可能是乳癌干细胞（breast cancer stem cells, BCSCs）的存在。BCSCs是一种细胞亚群，其参与肿瘤的起始、生长、转移、复发和对治疗的抵抗性。此外BCSCs可藉由细胞表面标志物CD44的表达和CD24（CD44＋ / CD24－）的缺失来监定，并且与治疗後低生存率有关。CD44的存在促进乳癌的肿瘤发生和转移，CD24的缺失也是如此。
此外，其他的BCSC标志物是醛脱氢酶1（Aldehyde Dehydrogenase 1, ALDH1），其与BCSCs的恶性程度增加、转移有关，而且许多分子信号传导途径有助於BCSCs的生长，包括自我更新，增殖，存活和分化。据文献【1, 2】指出，信号转导和转录因子3（Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的活化参与许多细胞过程，如增殖、存活、抗细胞凋亡、血管生成和转移，STAT3已被证明高度参与BCSCs的生长【1】。
有证据表明，与其他乳腺肿瘤细胞相比，具有CD44＋ / CD24－表型的BCSCs受Janus激酶2（JAK2）/ STAT3途径的调控【1】。此外，ALDH1阳性的乳癌细胞亚群表达的磷酸化STAT3水平高於不表达该干细胞标志物的细胞【3】。研究表明，NANOG与OCT4和SOX2是胚胎干细胞自我更新的关键转录因子，其中OCT4和SOX2在功能上依赖於STAT3【4】，NANOG用STAT3维持多能性和自我更新的细胞。
本研究作者探讨灵芝萃取物（Ganoderma lucidum extract，GLE）的新作用，证明它能通过抑制JAK2/STAT3途径和BCSC存活信号传导来抑制BCSCs。监於STAT3参与肿瘤发生，针对STAT3的新型治疗靶项标的开发成为预防人类恶性肿瘤，特别是TNBC的潜在机会【5】。
灵芝萃取物降低三阴性乳癌细胞株的存活率
作者发现灵芝萃取物GLE会显着降低三阴性乳癌细胞株MDA-MB-231的细胞存活率，当对细胞株施以GLE 24小时，可见GLE随着剂量越高，越能显着降低细胞存活率（图1），此证明GLE显着降低三阴性乳癌中的癌细胞活力。
图1 灵芝萃取物GLE对三阴性乳癌细胞存活率的影响
灵芝萃取物靶向STAT3和参与癌干细胞的转录因子
STAT3是STAT蛋白家族的成员，能够调控基本讯息传导路径，如增殖、分化、血管生成、细胞死亡和免疫反应。STAT3通过各种配体与它们各自的受体，包括介白素-6（IL-6），与其受体的结合，形成二聚化的受体并将JAK蛋白，特别是JAK1和JAK2组装到受体的细胞质结构域，启动JAK蛋白的磷酸化和活化。然後，活化的酪氨酸激酶JAK促进STAT3的召集，最终启动目标基因的转录。临床和临床前研究表明，JAK2 / STAT3讯息传导路径在大多数乳癌病例中被连续性活化，包括TNBC。据了解，STAT3在维持对干细胞表型的基因的表现方面具有重要作用，并用作CSCs的标志物；更重要的是，多年的调查和最近的一篇文章表明【6】，可能受STAT3激活的调控影响，转录因子NANOG、OCT4与SOX2一起在恶性表型细胞的发育中起重要作用。
监於灵芝萃取物GLE对肿瘤生长的显着抑制以及CSCs在这方面的作用，作者确定了GLE对JAK / STAT3信号传导的表达和活性以及参与自我更新的转录因子的影响，包括OCT4、NANOG和SOX2。
如图2A所示，以灵芡萃取物GLE的处理SUM-149细胞株（另一种三阴性乳癌细胞株）24小时，GLE可以显着降低STAT3、OCT4、NANOG和SOX2的基因表达；以GLE的处理MDA-MB-231细胞株，结果显示GLE也显着降低JAK2、STAT3和SOX2的基因表达，但增加NANOG的表达（图2B）。
因此，可证明灵芝萃取物GLE在作者的TNBC细胞株中降低STAT3的表达并活化STAT3的磷酸化，这可能调控降低参与自我更新的转录因子的表达。
图2 灵芝萃取物GLE对三阴性乳癌细胞株
STAT3、OCT4和SOX2的基因表达影响
灵芝萃取物降低ALDH1活性及CD44＋/ CD24－表达
STAT3已被证明是高度地参与BCSCs的生长，BCSCs可通过其标记物进行监定和分离：CD44＋ / CD24－和增加的醛脱氢酶1（ALDH1）活性。此外，STAT3磷酸化抑制剂（LLL12）通过凋亡诱导降低ALDH阳性群体、以及BCSC细胞活力、肿瘤形成能力和ALDH＋ 乳癌细胞的肿瘤生长。因此，作者检查了灵芝萃取物GLE抑制STAT3对BCSC特性的影响，包括靶向ALDH1阳性群体。GLE显着降低ALDH1活性（图3A）；而作者测量了两种TNBC细胞株中表达CD44和CD24的细胞的百分比。作者发现，CD44＋ / CD24－表达百分比皆降低（图3B）。
图3 灵芝萃取物GLE对三阴性乳癌细胞株
ALDH1活性和CD44＋ / CD24－表达的影响
灵芝萃取物抑制三阴性乳癌肿瘤生长和抑制STAT3信号传导途径
如先前所述，STAT3途径在维护BCSCs的至关重要的作用，如同 IL-6 / JAK2 / STAT3的途径和增加ALDH1的表达。在小鼠的动物实验中，若抑制STAT3，则也抑制肿瘤生长并减少ALDH阳性乳癌干细胞群。
正如作者已经表明在本研究及文献中，MDA-MB-231细胞有90%以上的CD44＋ / CD24－群体和比其它乳癌细胞株具有更高的STAT3活化。因此，作者观察灵芝萃取物GLE对MD3-MB-231细胞中STAT3信号传导和BCSC干细胞活力的肿瘤治疗潜力。作者发现，在小鼠中注射CD44＋ / CD24－乳癌干细胞，GLE显着抑制肿瘤体积（图4A）和肿瘤重量（图4B）。正如作者在体外结果中所示，GLE抑制STAT3信号传导途径，显着降低TNBC细胞株MDA-MB-231的BCSC的肿瘤体积和重量。
图4 灵芝萃取物GLE抑制三阴性乳癌小鼠的肿瘤生长
总之，上述研究成果显示，灵芝萃取物GLE藉由计画性细胞凋亡的方式杀死TNBC细胞，而GLE显着抑制BCSCs，如降低ALDH1 population和CD44＋ / CD24－stem-like population，藉由抑制STAT3信号传导以阻断自我更新的转录因子的表达。
此外，GLE显着降低了注射CD44＋ / CD24－乳癌干细胞的小鼠的肿瘤体积和重量，并显着降低了这些异种移植物肿瘤中STAT3的活化。这些结果表明，通过靶向BCSCs population，GLE可能是体外和体内TNBC的潜在新型治疗方法。
参考文献
1. Pires BR, et al. Targeting Cellular Signaling Pathways in Breast Cancer Stem Cells and its Implication for Cancer Treatment. Anticancer Res. 2016; 36: 5681-91.
2. Banerjee K, Resat H. Constitutive activation of STAT3 in breast cancer cells: A review. Int J Cancer. 2016; 138: 2570-78.
3. Lin L, et al. Evaluation of STAT3 signaling in ALDH+ and ALDH+/CD44+/CD24- subpopulations of breast cancer cells. PLoS One. 2013;8: e82821.
4. Wang ML, et al. Targeting cancer stem cells: emerging role of Nanog transcription factor. Onco Targets Ther. 2013; 6: 1207-20.
5. Rios-Fuller TJ, et al. Ganoderma lucidum extract (GLE) impairs breast cancer stem cells by targeting the STAT3 pathway. Oncotarget. 2018 Nov 13; 9 (89) : 35907-35921.
6. Galoczova M, et al. STAT3, stem cells, cancer stem cells and p63. Cell Mol Biol Lett. 2018;23:12.
