2018年10月5日／中国医药大学／Molecules
文／汪家仰（台湾大学生化科技学系硕士班一年级）、吴亭瑶
不管是投予荷尔蒙药物或是切除睾丸，都是临床常用的雄激素阻断疗法。其原理主要在减少或阻断雄激素与摄护腺癌（也称前列腺癌）细胞上的雄激素受体结合，使摄护腺癌细胞因为缺乏雄激素刺激而不再不断增生。但通常病情控制一段时间後，癌细胞会进化为2.0版，变得不需雄激素刺激也能生长，甚至变得更有侵略性，转移性更强，使治疗陷入困境。根据中国医药大学发表在《Molecules》的研究显示，松杉灵芝乙醇萃取物对於这种难治的摄护腺癌有很好的抑制生长、转移、侵袭和促使凋亡的作用。
癌症恶化会致使摄护腺癌的病人死亡，而摄护腺癌由「雄激素依赖型」恶化成难以治癒的「非雄激素依赖型」──亦即原本需要雄激素刺激才会生长的癌细胞，会恶化成不需雄激素刺激或极少量雄激素刺激即可持续生长──是目前临床治疗最大的挑战之一。
雄激素受体（androgen receptor，简称AR）受到雄激素刺激而活化，对摄护腺癌细胞的生长、存活和恶化扮演重要的角色。因此雄激素阻断疗法，也就是透过荷尔蒙治疗或切除睾丸抑制雄激素对雄激素受体的刺激，常是临床上给予摄护腺癌病人的第一线治疗。
然而大多数摄护腺癌病人在治疗一段时间後，会进一步恶化成致命的「非雄激素依赖型」，因此开发防治非雄激素依赖型摄护腺癌的治疗新方法是十分必要的。
目前研究表明，活化脂质的生合成和摄护腺癌的恶化有相关性，而SREBP-1（Sterol regulatory element-binding protein-1，固醇调控元素结合蛋白-1）是一种调控脂质合成的关键转录调控因子。此外，在摄护腺癌从「雄激素依赖型」转变为「非雄激素依赖型」的过程中，雄激素受体也扮演重要的角色。
2018年10月中国医药大学发表在《molecules》期刊上的研究表明，松杉灵芝子实体乙醇萃取物（Ganoderma tsugae ethanol extract，简称GTEE）可以有效抑制摄护腺癌细胞中SREBP-1及其下游与脂质合成相关基因的表达。
通过抑制SREBP-1，松杉灵芝乙醇萃取物GTEE可以减少摄护腺癌细胞中脂质的合成，更重要的是，可以降低雄激素受体和摄护腺特异性抗原（PSA）在雄激素依赖型和非雄激素依赖型摄护腺癌中的表达。
通过阻断SREBP-1/AR这条信号通路，GTEE不仅抑制了癌细胞的生长和转移，也造成了摄护腺癌细胞的凋亡。此研究结果阐述了松杉灵芝乙醇萃取物GTEE防治摄护腺癌恶化的分子机制，为松杉灵芝乙醇萃取物在这方面的开发应用提供重要的基础。
实验结果1：抑制SREBP-1及雄激素受体的基因和蛋白表达
从qRT-PCR（图1 A）和Western Blot（图1 B）的检测结果来看，松杉灵芝乙醇萃取物GTEE对於摄护腺癌细胞中SREBP-1及其下游相关基因FASN和AR（雄激素受体）的表达有显着的抑制作用。
图1 松杉灵芝乙醇萃取物GTEE抑制摄护腺癌细胞中
SREBP-1及其下游相关基因和蛋白的表达
〔说明〕LNCaP为雄激素依赖型人类摄护腺癌细胞株，C4-2为CRPC型（亦即非雄激素依赖型）人类摄护腺癌细胞株。（图1 A）为利用qRT-PCR技术进行检测基因表达量获得的结果，（图1 B）为利用Western Blot方法检测蛋白表现量获得的结果。图中的Vehicle和β-actin为对照组。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001代表与对照组（Vehicle）比较有显着差异性。
实验结果2：抑制癌细胞中的脂质合成量
由图1和图2的结果来看，松杉灵芝乙醇萃取物GTEE可以通过抑制摄护腺癌细胞中SREBP-1和其下游相关基因FASN和AR的表达，使癌细胞内的脂肪酸含量和脂质累积减少。
由於癌细胞内的脂质含量与癌细胞的生长和恶化呈正相关，也有研究认为癌细胞中的脂质是癌细胞的能量来源，因此，松杉灵芝乙醇萃取物GTEE可使摄护腺癌细胞中的脂质减少，可视为摄护腺癌细胞受到抑制的表徵。
图2 松杉灵芝乙醇萃取物GTEE减少摄护腺癌细胞中
脂肪酸（A）和脂质（B）的累积
〔说明〕在摄护腺癌细胞中加入松杉灵芝乙醇萃取物GTEE（0.2或0.4 mg/mL）或0.3%乙醇（Vehicle组）一起培养24小时，脂肪酸（图2 A）和脂质（图2 B）在细胞中的相对含量占比。脂肪酸的含量测定使用fatty acid quantification kit，脂质累积测定使用Oil Red O染色。
*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001代表与对照组比较有显着差异性。最下面一张图中箭头所指的是癌细胞内的脂质微滴，图上右下角的黑色比例尺的长度＝100μm。
实验结果3：抑制癌细胞生长
由图3结果来看，不同浓度的GTEE和不同的作用时间，都可对摄护腺癌细胞的生长产生抑制作用，其对雄激素依赖型人类摄护腺癌细胞株LNCaP的半数抑制浓度（IC50）为0.746mg/mL（处理48小时）；其对非雄激素依赖型人类摄护腺癌细胞株C4-2的IC50则是0.735 mg/mL（处理48小时）。
图3 松杉灵芝乙醇萃取物GTEE抑制摄护腺癌细胞生长
〔说明〕在摄护腺癌细胞中加入不同浓度（0.2～1 mg/mL）松杉灵芝乙醇萃取物GTEE一起培养24小时、48小时、72小时後，以MTS assay方法测定癌细胞的生长情形（数据呈现的是：癌细胞数量为对照组Vehicle的几倍）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001代表与对照组比较有显着差异性。
实验结果4：抑制癌细胞的移动力与侵袭力
综合图4 A和图4 B的体外实验结果表明，松杉灵芝乙醇萃取物GTEE对「雄激素依赖型」和「非雄激素依赖型」的摄护腺癌细胞，都有抑制转移的作用。
图4 松杉灵芝乙醇萃取GTEE对摄护腺癌细胞
移动力和侵袭力的抑制作用
〔说明〕在摄护腺癌细胞中加入不同浓度松杉灵芝乙醇萃取物GTEE一起培养，以wound closure方法（图4 A）和Boyden chamber方法（图4 B）分析癌细胞的移动能力和侵袭能力。**p < 0.01，***p < 0.001代表与对照组（Vehicle）比较有显着差异性。
实验结果5：促使癌细胞凋亡
从图5 A～C的实验结果可知，松杉灵芝乙醇萃取物GETT对於「雄激素依赖型」和「非雄激素依赖型」摄护腺癌细胞都有促进凋亡的作用。
综合这些实验结果可知，不管是对於「雄激素依赖型」或「非雄激素依赖型」的摄护腺癌细胞，松杉灵芝乙醇萃取物GETT都能通过抑制SREBP-1，减少雄性激素受体，进而降低癌细胞的生长、转移和侵袭能力，并促使癌细胞凋亡。这说明，松杉灵芝乙醇萃取物GTEE有潜力发展为防治摄护腺癌细胞恶化的药物。
图5 松杉灵芝乙醇萃取GTEE经由活化凋亡蛋白的路径
诱导摄护腺癌细胞凋亡
〔说明〕把摄护腺癌细胞和不同浓度松杉灵芝乙醇萃取物GTEE一起培养，经过24小时後，不管是雄激素依赖型的LNCaP或非雄激素依赖型的C4-2，癌细胞凋亡的比例会随GTEE浓度的增加而增加（图5 A），测得的凋亡蛋白（caspase 3和7）活性也和GTEE浓度呈正相关（图5 B）。***p < 0.001代表与对照组（Vehicle）比较有显着差异性。
此外，当摄护腺癌细胞和1.2 mg/mL的GETT培养20小时後，可以验出大量被剪切过的凋亡蛋白（C-caspase 3），caspase 3在经过剪切後会被激活成为细胞凋亡的执行者，它的出现代表细胞只有凋亡一途，无法再走回头路（图5 C）。
图5 D则总结了松杉灵芝乙醇萃取物GETT抑制摄护腺癌细胞（包括雄激素依赖型和非雄激素依赖型）的作用机制：通过抑制SREBP-1，减少雄性激素受体（AR），进而降低癌细胞的生长、转移和侵袭能力，并促使癌细胞凋亡。
〔资料来源〕Huang SY, et al. Ganoderma tsugae Inhibits the SREBP-1/AR Axis Leading to Suppression of Cell Growth and Activation of Apoptosis in Prostate Cancer Cells. Molecules. 2018 Oct 5;23(10). pii: E2539. doi: 10.3390/molecules23102539.
