〔2015灵芝研发与应用学术研讨会系列报导〕台大许瑞祥教授演讲：灵芝免疫调节蛋白的开发与应用

发布时间: 2015-06-24 06:16

作为大会第一位演讲者，许瑞祥教授把重心聚焦在小孢子灵芝免疫调节蛋白 GMI 的发现、研发、量产与应用。预计从2016年开始将有 GMI 的保健食品在美国正式上市，这将是第一个成功商品化且打入国际市场的灵芝单一活性成分，而「可以量产」则是此活性蛋白比灵芝多醣和三萜提早达阵的关键因素。（感谢许瑞祥教授审稿）

主讲／许瑞祥整理／吴亭瑶

作为〈2015灵芝研发与应用学术研讨会〉第一位演讲者，台大许瑞祥教授把重心聚焦在小孢子灵芝免疫调节蛋白 GMI 的发现、研发、量产与应用，不仅紧扣此次灵芝研讨会「研发」与「应用」两大主题，更呼应大会主席林志彬教授强调灵芝进军国际的必备条件──安全、有效，质量可控。

诚如许瑞祥所言，「我们研究灵芝这麽久，当然希望灵芝的成分可以改善人类和动物的健康」，这个愿望终於实现了。具抗发炎、抗氧化、调节免疫、调节血糖、抗癌等众多功效的 GMI，预计2016年将以膳食补充品（dietary supplyment）的型式在美国正式上市，这将是第一个成功商品化，且打入国际市场的灵芝单一活性成分，其之所以能比灵芝多醣和三萜提早达阵的原因，「可以量产」是主要关键。

GMI 的产业化将把灵芝的应用带入另一个新时代，但演讲一开始，研究灵芝栽培与菌种监定起家的许瑞祥还是从最基本的「何谓赤芝」谈起，因为唯有追本溯源把根本弄清楚了、稳固了，其所展望的未来才会踏实可行。

以下以第一人称呈现许瑞祥教授的演讲精华。

2015-rsh2

许瑞祥教授的灵芝研究历程

1981～1989年：以形态分类、生化特性、交配育种研究灵芝，开发、提供生产和研究用的菌株。

1990～1999年：建构灵芝属的分子生物学监定系统（以基因监定灵芝），提供确认物种的平台技术。

2000年迄今：以灵芝特殊基因的开发应用为主，将灵芝里的功能性蛋白单独开发应用。

赤芝不只一种，Ganoderma lucidum 同名异种问题严重

《中华人民共和国药典》把多孔菌科的赤芝（Ganoderma lucidum）和紫芝（G. sinenese）列为药材。但什麽灵芝是赤芝？赤芝的学名是否为 G. lucidum？这是作为灵芝发源地的中国，不论学术界或产业界，必须深刻思考的问题。

三十年前我刚开始做灵芝研究时，台湾灵芝农场种的都是红色灵芝，他们都说种的是赤芝，也就是 G. lucidum，但我怎麽看都觉得那里面的灵芝并非只有一个物种。

於是我花了六年的时间（1984～1990年）建立「灵芝分类监定系统」当作我的博士论文^（¹^），经比对某一特定区段的基因序列（限制酶水解基因片段多型性图谱），确定台湾农民常种的红色灵芝其实包含两个种：G. lucidum 和 G. tsugae（松杉灵芝），而这个物种是无法交配的，所以确定是两个完全不同的物种（图一）。

GMI-01

〔图一〕1989 年许瑞祥以人工栽培获得的灵芝（G. lucidum，图左）与松杉灵芝（G. tsugae，图右），

它们无法交配产生下一代，因此确定是两个完全不同的物种。（提供／许瑞祥）

1995 年我们把世界各地收集到的红色灵芝，以基因监定的方式（比对核糖体的基因序列）进行分类，结果发现可以分出很多群，这表示不同国家地区所指称的G. lucidum实际并非同一物，而是包含好几个不同的物种（图二）^（²^）。

为了帮助大家快速确认自己用的是什麽菌种，我们找到了一个功能性基因──超氧歧化酶（SOD）的基因──它带有一个非转译区的序列，可以把灵芝属菌株分得很清楚（图三）^（³^）。

所以，我相信过去中文文献上所写的「赤芝」至少包含：G. lucidum（灵芝）、G. tsugae（松杉灵芝）、G. capense（薄树芝）、G. boninense（狭长孢灵芝）、G. tenue（密纹薄芝）等栽培种类。

西方文献中所指的「G. lucidum」就更复杂了，可能包括：G. ahmadii、G. boninense、G. lucidum、G. oregonense、G. pfeifferi、G. resinaceum、G. tsugae、G. valesiacum……等种，这些物种在不同的国家地区都被用 G. lucidum 当学名。

〔图二〕利用核糖体基因序列分析不同地区红色灵芝的亲缘关系。（提供／许瑞祥；点选图片可放大）

〔图三〕利用 Mn-SOD 基因序列进行灵芝属菌?类源关系监定之结果。（提供／许瑞祥；点选图片可放大）

Ganoderma lingzhi 是.......？

最近对於什麽是 G. lucidum 又有一些讨论。2012年戴玉成、吴声华等提出，两岸常用的 G. lucidum 应该是一个新的物种，叫作 G. lingzhi（图四）^（4^、5^）。G. lingzhi 到底指的是什麽？仔细看他们发表的论文会发现，他改成 G. lingzhi 的第一支菌株，就是 1994 年我做基因监定的松杉灵芝。

在此要说明的是，1990年我博士论文所指的灵芝和松杉灵芝，是根据当时中国科学院邓叔群先生所监定的 G. lucidum ，以及徐连旺先生所监定的松杉灵芝 G. tsugae标本，作为分类监定的依据（图五）。所以他们等於就是把我监定的松杉灵芝改名为 G. lingzhi 而已。

我个人觉得，如果分类一直改新学名，会让学术界、产业界、产品开发在国际上造成极大的困扰，因为到底你用的是什麽材料，大家会搞不清楚。要用哪个学名来代表大家栽培常用的灵芝，可以再思考，没有定论，但自己栽培的到底是哪个物种的哪个品系，绝对要弄清楚。

〔图四〕有学者认为，两岸常用的「赤芝」是新的灵芝菌种。（资料来源／截取自《自由时报》网站 2012 年 7 月 6 日〈生活版〉新闻；点选图片可放大）

〔图五〕图左中国科学院邓叔群先生监定的灵芝（G. lucidum），

图右为徐连旺先生监定的松杉灵芝（G. tsugae）。

（提供／许瑞祥；点选图片可放大）

灵芝免疫调节蛋白的发现

灵芝的有效成分，包括多糖、三萜、腺苷等等，从 1971 年开始陆续被发现。1989 年，日本学者 Kino 在灵芝菌丝体里找到一个活性蛋白，把它叫作 LZ-8。

当初发现 LZ-8 时，就知道它可以促进淋巴细胞分裂、抑制某些过敏反应、改善第二型糖尿病......。有趣的是，LZ-8 会凝集羊的红血球，但不会凝集人的红血球，代表它可能可以在人体内发挥一些作用。

这类蛋白因为具有调节免疫的作用，所以现在都被统称为 fungal immunomodulatory protein（真菌免疫调节蛋白，简称 FIP），而且不是只存在於灵芝（G. lucidum），许多菇类，包括金针菇、草菇、松杉灵芝、日本灵芝（G. japonicum）、小孢子灵芝（G. microsporum）、紫芝（G. sinense）等等，都有这类蛋白。最新的文献甚至指出^（⁶^），连子囊菌纲的真菌也可找到类似的蛋白，这表示在所有真菌家族演化的过程当中，都有这类蛋白存在。

正因为它是蛋白，可以透过基因转译大量生产，因而能够比多醣和三萜更快被产业化应用。我接下来要报告的，就是这个蛋白被产业化应用的具体结果。

灵芝免疫调节蛋白的相关专利

一个成分能否被产业化应用，除了看它的科学文献之外，还要看它的相关专利。我把这类蛋白的专利分成四个部分：

第一部分是有关 LZ-8 的序列调整、更改，以及建构这类蛋白大量生产的表达系统，上海交通大学在这方面有一系列的专利。

第二个部分是吉林大学医学院申请的专利，主要在做这类蛋白的分离、纯化和功能，包括诱发癌细胞凋亡、减少缺血性损伤、治疗血小板减少症等。从专利内容和这些专利是与几家产业公司合作申请的，可以看出他们正针对某个特定主题，为 LZ-8 的产业开发做准备。

第三部分是由台湾的台北医学大学把 LZ-8 拿来做促进伤口癒合的专利。更早之前，还有台湾业者这个蛋白应用於免疫调节、改善第二型糖尿病、降低器官移植排斥效应等。

第四部分要和大家详述的专利是 GMI，也是今天我报告的重点，它在抑制癌干细胞和促进神经细胞生长方面的专利已在申请中。

GMI 的发现与量产

GMI 是从小孢子灵芝（图六）拿到的一段免疫调节蛋白基因，它的基因序列和 LZ-8 类似，但又不完全一様。当时为了避开 LZ-8 被日本学者专利的基因部位，我将手上众多的灵芝菌种以 genome walking 的方法进行基因选殖，发现有某些物种的基因序列和 LZ-8 不一様，而 GMI 就是其中之一。

把它送到嗜甲醇酵母菌进行表达，结果发现，表达出来的蛋白，不论分子量或基因序列，都和原本的 GMI 完全一様。随後再把这个蛋白纯化做成结晶，可以看出它是由四个单体组合而成（图七），和 LZ-8、金针菇免疫调节蛋白（FIP-fve）的立体构造非常相似，但仍有些微差异（图八），而这些差异正是造成它们功能上有所不同的原因。^（7^）

〔图六〕1989 年由许瑞祥所命名的新种灵芝──小孢子灵芝（G. microsporum）。（提供／许瑞祥）

GMI-07

〔图七〕来自小孢子灵芝的 GMI 蛋白，是由四个单体组合而成。（提供／许瑞祥）

GMI-08

〔图八〕GMI、LZ-8、金针菇的免疫调节蛋白（FIP-fve）的结晶有「大同小异」的立体结构，

这些些微差异，正是造成它们在功能上有不同表现的关键因素。（提供／许瑞祥）

为了验证这个成分能否被产业化，我们开始建构生产技术来生产这个蛋白。以酵母菌 Pichia pastoris 液态发酵生产 GMI 为例，已经完成 5,000 公升发酵槽的生产配方与产程调控技术，每公升培养液可回收、纯化重组蛋白达 0.5 公克以上。

目前这个蛋白在发酵槽生产後，经过回收、浓缩、纯化，可以做出 95% 以上纯度和 75% 以上纯度的蛋白。未来如果当作蛋白药物使用，可以用前者来做；当作食品用後者来做即可。

GMI 有多种功能性，口服就有效

当你可以大量表现这个蛋白时，就能给很多科研单位做功能性实验。目前为止，GMI 在细胞与动物实验被证实，在相对低剂量下（5 ug/ml），具有刺激人类 T 细胞株分泌 IL-2、降低发炎因子分泌、抑制 NF-κB 转录活性、抑制肿瘤生长和转移，以及诱发肿细胞凋亡等能力，显示其可用於调节免疫、调节血糖、抗癌与辅助抗癌等蛋白质药物的开发。动物实验也证实，GMI 可以促进离乳小猪的存活率达到 100%。此外，GMI 还可促进神经细胞再生。

● 美国 NIH 证实 GMI 对多种癌细胞有效

这个蛋白要产业化，必须经过第三方公正单位的评估，因此我们委托美国国家卫生研究院（National Institutes of Health，为美国联邦政府中首要的生物医学研究部门）以 9 种不同的癌，共计 60 个癌细胞株，对 GMI 进行实验。

实验结果详见下图（图九），往上的长条图代表它有杀死癌细胞的能力，往下的长条图代表它有抑制癌细胞生长的能力，这说明了 GMI 对於美国人常见的癌症，包括：血癌、非小细胞肺癌、大肠癌、中枢神经癌、黑色素瘤、卵巢癌、肾脏癌、前列腺（摄护腺）癌，以及乳癌，都有不同程度的抑制或杀癌细胞的能力。

GMI-09

〔图九〕美国国家卫生研究院证实，GMI 对美国人常见的 9 种癌症有抑制作用。（提供／许瑞祥）

● GMI 的有效剂量很低

我们也与不同的学术单位合作，对GMI抑制非小细胞肺癌、乳癌、口腔癌等细胞株的作用进行实验。值得注意的是，它的剂量单位是 micromolar（μM），换算成重量就是microgram（即 μg，微克），千分之 mg（毫克），代表它很容易达到有效剂量。

动物实验即证实，以口服方式喂食非小细胞肺癌的动物 GMI，每公斤体重喂食 4～8 mg 就能产生抗肿瘤作用，这个浓度比起灵芝其他有效成分相对低很多。

● GMI 抑制非小细胞肺癌

2011 年，我在北京举办的〈国际灵芝研究学术会议〉报告时，曾放了这张投影片（图十），这是当时 GMI 最新的报告^（8^），喂食接种非小细胞肺癌的小鼠，比较「有用」和「没用」GMI 的肿瘤大小，证实口服 GMI 确实是有效的。至於这个蛋白质为什麽口服有效，目前还不清楚。

〔图十〕灵芝GMI对小鼠的非小细胞肺癌肿瘤，有显着的抑制作用。

（资料来源／Autophagy, 2011, 7(8): 873-882. 点选图片可放大）

● GMI 抑制口腔癌干细胞

GMI 不只对一般的细胞株有效，对癌干细胞（cancer stem cell）也有效。癌干细胞是癌细胞分化前的母细胞，治疗癌症时，如果癌干细胞没被清除掉，很容易使得原本好转的病情再度恶化而出现扩散和转移，因此医学界希望能用标靶的方式找到癌干细胞，进而抑制它或杀掉它。

而根据我们的细胞实验结果，不同浓度的GMI可以对这些带有特殊分子标记的癌干细胞产生抑制作用；动物实验也证实，每天给小鼠吃 150 μg 的 GMI，可明显抑制口腔癌干细胞的生长，此结果再次说明这是一个口服有效的蛋白。

● GMI 有抗氧化作用

另外我们也发现，这个在细胞外没有抗氧化能力的蛋白，在细胞内可增强维生素C的抗氧化能力。

● GMI 促进神经细胞再生

至於 GMI 对神经细胞再生的作用，我们做了两个实验，一个是前处理（先给 GMI再伤害神经细胞），另一个则是同时处理（给 GMI 和伤害神经细胞同时进行）。结果发现，年轻的神经细胞，不管是前处理或同时，都会看到 GMI 有明显的促进再生作用；对老的神经细胞，同时处理是没效的，必须前处理才有效。这表示经常吃这个蛋白，神经受损比较容易恢复。

● GMI 对脑中风的保护作用

在中风大鼠的实验模式下，给大鼠静脉注射 GMI。结果从脑部切片发现，当 GMI 注射剂量为 3.3 μg/kg 时，大鼠脑部受到的氧化伤害，比没注射 GMI 者要少很多。

GMI有食品等级的安全性

以上介绍的是 GMI 的药用用途，接下要和大家报告 GMI 作为食品添加物和保健食品的用途，相信 GMI 在这方面的应用可以让它的开发更宽广。作为一个食品的首要条件是它的安全性，我要再次强调，一个成分一定要先求安全，再求确效，最後才是量产。

根据 GMI 的安全评估报告，在急毒性与亚慢毒性的动物毒理实验条件下，以 150 mg/kg 剂量的 GMI 连续 14 天，以及 100 mg/kg 剂量的 GMI 连续 90 天喂食大鼠，并未发现任何不良反应，显示它具有食品等级的安全性。

在如此高度安全和功能的条件下和，GMI 已取得美国食品药品管理局（U.S. FDA）新膳食成份上市前通知（New Dietary Ingredient Notification），预计从2016年开始就会有 GMI 产品在美国贩售，而产品的保健诉求将涵括抗发炎、抗氧化、免疫调节、调节血糖等功效。

GMI可以提高动物的抵抗力、存活率、饲料换肉率

除了药品、保健食品，动物保健食品市场也是我们关注的另一个焦点。把 GMI 用在宠物身上，可以对 O-157 出血性大肠杆菌引起的急性肠道发炎，发挥抑制发炎、保护肠黏膜的作用，此结果让我们相信 GMI 可以被开发成饲料添加物。

动物实验也证实，把这个蛋白以 20 μg/kg 的剂量添加到饲料里，可以增加饲料换肉率，提高保育猪的存活率，减少抗生素的使用，提高疫苗的效价。以下这张图（图十一），左边是有吃 GMI 的母猪，右边是和母猪同个时候出生的公猪，但没有吃 GMI。自然界的动物通常是公的体积比母的大，但原本同様大小的小猪，40 天後母猪竟长得比公猪大，明显可以看出有无喂食 GMI 的差别。

GMI-11

〔图十一〕有吃 GMI 的母猪（图左）长得比同龄却未吃 GMI 的公猪（图右）大，

显示 GMI 能提高饲料换肉率。（提供／许瑞祥）

GMI可以量产，极具市场竞争力

总结来说，这个蛋白目前因为可以量产，而且功效明确、安全性高，将来在食品、药品、美容保养品、动物饲料等的应用上，都可直接产业化和商品化。我们研究灵芝这麽久，当然希望灵芝的成分可以改善人类和动物的健康。多醣和三萜要萃取，可能它的价格会是一个门槛，而这个蛋白可以大量被表现，因此它的价格应该会极具市场竞争力。

参考文献

1. 许瑞祥，1990，灵芝属菌株监定系统之研究，国立台湾大学农业化学所博士论文。

2. Moncalvo JM, et al. 1995. Rhylogenetic relationships in Ganoderma inferred from the internal transcribed spacers and 25S ribosomal DNA sequences. Mycologia, 87: 223-238.

3. 王惠芳，1996，灵芝属含锰超氧歧化酶基因之研究，国立台湾大学农业化学研究所硕士论文。

4. Cao Y, Wu SH, Dai YC. 2012. Species clarification of the prize medicinal Ganoderma mushroom “Lingzhi”. Fungal Diversity, 56:49-62

5. 戴玉成等，2013，中国灵芝学名之管见，菌物学报，138(06) : 947-952.

6. Bastiaan-Net S,et al. 2013. Biochemical and functional characterization of recombinant fungal immunomodulatory proteins (rFIPs). Int Immunopharmacol. 15:167-175.

7. Wu MY, et al. 2007. A 2.0 ? Structure of the Fungal Immunomodulatory Protein GMI from Ganoderma microsporum. 台湾大学生化科技学系会议论文。

8. Hsin IL, et al. 2011. GMI, an immunomodulatory protein from Ganoderma microsporum, inducesautophagy in non-small cell lungcancer cells. Autophagy 7:8, 873-882.