灵芝也可以做成一颗颗半透明的「珍珠圆」？作者回顾三十年前如何在经费拮据下就地取材，DIY出一套既节能又环保的「灵芝菌丝球生产器」，为时任北医院长的董大成教授研究「灵芝多醣抗癌」提供稳定的实验材料。董教授还把这些带有菇菌香气、一点点甜、口感像爱玉的灵芝珍珠分送实验室十几人天天吃，一个月下来大家的免疫力都变好了……
文／苏庆华
◎本文原载於2015年《健康灵芝》第66期 2～5页
1985年来到北医後，当时的校长董大成教授研究灵芝已经两、三年的时间了，却一直苦无稳定且成分较为固定的材料。那时候大家对灵芝还没有很清楚的认识，很多人提供的都是号称「依循古法」炼制的灵芝，以现在的看法，大概只是含有一些多醣的样品。即使如此，董教授把这些样品用在研究免疫抗癌，也都会得到一些正面的结果，只不过每次实验的结果都不稳定。
所以，我来到北医的第一个任务就是培养灵芝。然而灵芝有不同生长阶段的产品，就如我们所熟知的菌丝体和子实体，董教授和我讨论後决定以菌丝体的培养作为开始，也较符合他以免疫抗癌为主的研究方针。至少，我的加入应该对材料的准备会有一些帮助。
无意间发现灵芝菌丝会形成漂亮的菌球
於是我开始准备瓶瓶罐罐，这些事情对我来说已经驾轻就熟，因为只要把过去培养植生虫草的经验移植过来就行了，而且灵芝的生长条件也十分类似。
在向菌种中心购得菌种後，开始繁殖放大培养，从试管到培养皿，再从培养皿到三角锥瓶，进入震荡摇床液态培养。由於灵芝是一种好氧的真菌，如果在三角锥瓶液态培养基中静置培养，灵芝便会在液面形成一层菌丝，并逐渐成为类似海绵组织的菌丝饼。
只是这样的培养方式对於多醣的产生比较没有帮助，如果能让三角锥瓶在震荡的情况下，整个液态培养系统都能提供均匀的氧气，菌丝即可平均分布在培养液中，一方面震荡培养的发酵效率较高，另一方面菌丝所产生的多醣也因为震荡而释放到培养液中，可以让後来的纯化工作减少一道萃取的手续。
震荡培养有两种方式，一种是往复式，另一种是回转式。往复式常会产生很大的噪音，也要用到特殊的坂口瓶（Sakakuchi flask）；回转式虽然效率低一些，但较安静，且可使用普遍可购得的三角锥瓶，这也是选择震荡培养的一些考量。
由於实验室才刚刚建立，所需要的设备东缺西缺的，好在国科会的研究计画顺利通过，让震荡培养设备得以陆续到位而可开始进行测试。测试的项目包括回转速、培养基组成等条件，经过这些程序後发现，回转式震荡培养不同於过去植生虫草会产生棉絮样的菌丝体，灵芝会形成大大小小很漂亮的菌球。
当初也没特别注意到这个特性，主要的任务是把样品提供给董教授测试，董教授也觉得相当满意。然而一个震荡培养器每次培养约两星期大概只能生产1.5公升左右的培养液，纯化出来的多醣对当时董教授的大量动物试验是不足的，因此要再放大实验室的产能，只有购入较大的震荡器，或用较大的发酵槽。
由於实在没有空间来安置大的震荡设备，也没有经费购买动辄百万的发酵槽，所以只好就地取材想出一套可用、省钱又有效率的方法。
经费有限下自制大量发酵装置
在先前的专栏文章中即曾提到（详见《健康灵芝》59期2～5页），我的实验空间本来是生药实验室，有点像中世纪的炼丹房，留下许多不同大小、各式各样的玻璃瓶，这是我喜欢的东西之一，不像很多人会把它们清掉。我看中其中一个最大的20公升三口瓶，估计它至少可以装16公升的培养液（不能装到满），这样发酵一次就可以抵至少十次以上的震荡培养。
一开始我思考的是，如何灭菌和培养供气。很刚好，这个三口瓶的大小可以放到灭菌釜中，也就是灭菌篮的直径恰好放得下，如此一来灭菌就没问题了。再者，如前所述，灵芝需要氧，因此要长时间通气，於是我又买了一个养金鱼的空气帮浦作为供氧来源。
由於不能供给有杂菌的空气，空气都必须过滤，因此就用大的100 mL玻璃针筒塞上玻璃棉，其後再加一个飞碟型的细菌过滤器（0.2 μm孔洞），如此便可阻绝空气中的污染源。
至於管路则用实验室现成的玻璃管、矽胶橡皮塞，以及耐高温的矽胶软管来衔接。一般市售的塑胶空气分布器（sparger）因不耐灭菌的高温而无法使用，因此空气在培养瓶底部的出口，便以一小段矽胶软管打数个洞来取代，作为分散空气增加与液面的接触面。
总之，一切考量都是以采用可高温高压灭菌的材质为原则，例如：玻璃、玻璃棉、矽胶软管、矽胶橡皮塞等，这些都事先经过测试，证明养金鱼的空气帮浦经过过滤装置後仍可推动此一系统；另外还安装了取样口、空气出口、培养液补充口，以备不时之需（如下图）。
由於最贵的三口瓶是现成的，买个养金鱼的空气帮浦约一、两百元，连接通气系统的玻璃管可以用本生灯烧成需要的角度，橡皮塞、矽胶管、注射筒等都可用实验室现成的东西加以组装，所以整个装置完成後几乎花不了多少钱。
一切准备就绪之後，先把注入培养液的三口瓶和管路分开灭菌，待冷却後於无菌室接种，再加以组装，即可进行发酵操演。这时，小小的菌丝接种点就会随着扬升的气泡上下滚动，逐渐长大形成一颗颗灵芝菌丝球。
实验室生产灵芝珍珠圆的装置
1. 养观赏鱼的空气帮浦；2. 粗空气过滤；3.细空气过滤
4. 冷却水入口；5. 冷却水出口；6. 取样口；7. 进气口
8. 出气口；9. 培养液补充口；10. 空气分布器
（绘图／苏庆华）
灵芝菌丝发酵的培养基也可以DIY
如前所提，利用回转式震荡培养会形成菌丝球，但以这种空气搅拌的方式，菌丝球会更为均匀，且有晶莹剔透之美感。经过大约两个星期，发酵就告完成。至於发酵的终点，一方面可观察培养液中菌丝球生长的密度分布在增加，另一种较科学的方式则是：
自取样口采样分析葡萄糖残余量，如果没有葡萄糖剩下，就是生长终点了。取样的方法很简单，只要用燕尾夹夹住关闭出气口，打开取样口即可，因为在空气帮浦通气加压之下，培养液会从取样口自动流出来，每次取样只需数毫升就足够分析了。
通常我会加入比一般真菌培养基更多的葡萄糖，大约 4～5 %（一般约 1～1. 5 %），主要的目的是让多醣的产率提升。也因为这样，到了培养後期，经常可以看到培养液变得较为黏稠，显示多醣已经释放至培养液中。
培养液除了添加葡萄糖作为碳源之外，也需要氮源及矿物质。这些氮源和矿物质可以向试药行购买现成的酵母萃取物（yeast extract）、麦芽萃取物（malt extract）或马铃薯葡萄糖培养基（potatoes dextrose broth），但最省钱的方式还是DIY――到市场买一些马铃薯，去皮、切丁，在沸腾的热水中煮三十分钟，趁马铃薯丁还没煮烂之前过滤，取滤液加葡萄糖溶解後即可，大约200克马铃薯可做出1公升的培养液。
灵芝珍珠圆把免疫变好了！
所以整个过程都是用最节省的方式完成，培养过程也没有污染，灵芝菌丝的生长也很有趣，董教授甚至带很多学校的外国来宾前来参观，彷佛这里是一个观光景点。其实这种培养方式就是所谓的「气举式发酵（air lifter fermentation）」，有别於机械搅拌式，虽然发酵效率稍微缓慢，但不会把菌丝球搅碎而易於分离菌丝和菌液。
由於培养液在发酵完成後会呈现带有黏性的淡黄色透明胶状液体，半透明的菌球很均匀地分布其中，很像後来大为流行的珍珠粉圆，所以就称之为「灵芝珍珠圆」吧！要将菌液与菌丝分开也很容易，只要过一下泡红茶的不锈钢滤网，灵芝菌丝球便会留在网内澄清的菌液即可经过超微过滤、冷冻乾燥，成为纯白的多醣。
董教授除了拿我纯化後的多醣喂养动物之外，後来还发现，尚未处理的灵芝珍珠圆放在冰箱存放一、两天後，居然形成果冻状，看起来很可口的样子。於是董教授便请助理分装在约 100 mL 的冰淇淋盒子中，请实验室总共约十五位的老师、学生、研究助理每天吃一盒，连续三十天的时间。至於灵芝珍珠圆吃起来的味道，有点像爱玉，还带点菇菌的香气，虽然葡萄糖都已转化成菌丝及多醣，但仍有一点点甜味。
每个人在吃灵芝珍珠圆的前、中、後要各抽一次血，用来检查免疫细胞的变化。当时董教授刚租了一台第一代的流式细胞仪（flow cytometer），因此除了享用灵芝珍珠圆可以玩新的仪器之外，最重要的当然是免费了解自己的免疫状况，那时在医院分析一次可能要数千元之谱。
就在大家玩得很高兴之际，董教授把数据和大家分享，结果显示，吃了一段时间的灵芝珍珠圆之後，大部分免疫细胞的比率都显着改善，其中尤以T4细胞最为明显。
现在回想起来，我们早在二十几年前就把所谓的「活灵芝」玩过一遍了。最近市面上也看到类似的产品，只是灵芝菌丝都打散呈棉絮状，失去台湾美食珍珠粉圆的外观，令人感到有点可惜。推测可能在培养菌丝时是用机械搅拌的方式，而不是用气举式发酵。
可惜了那些营养丰富的马铃薯煮液
去年（2014）八月，随着生技界人士前往内蒙参访，了解到内蒙是马铃薯的重要产地，也有很大的企业生产马铃薯淀粉。生产过程中，马铃薯必须先煮过後再将淀粉分离出来。煮过马铃薯的煮液富含氨基酸、微生素及矿物质，也就是我们作为马铃薯培养基的主角。
座谈会中，我请教企业家如何利用这些煮液，他们马上眼睛发亮，表情中又带有些许愧意，原来这些很营养的煮液都被当成废液处理，不仅没有好好利用，还要缴水污费进行分解。
我於是提出灵芝珍珠圆的经验，他们也深感兴趣。只是对他们而言，要投资大型气举式发酵系统，还有大陆对灵芝「菌丝阶段」产品的陌生，在对市场销售不是很有把握的因素下，这个案子也就停留在规划阶段。（注：大陆称菌丝为第一阶段，子实体为第二阶段，孢子粉为第三阶段，最常见的灵芝产品原料是孢子粉。）
当然，掌握丰富的发酵资源是生物科技很重要的优势，能够利用几乎不用钱的马铃薯煮液来生产有趣、健康又好吃的灵芝珍珠圆，一直是我最感兴趣的课题。
