〔苏庆华谈灵芝废渣／敷料〕灵芝子实体萃取後残渣再利用，促进角膜上皮细胞再生

发布时间: 2015-06-01 06:16

灵芝子实体萃取後废渣的主要成分「几丁聚醣」，早已被证实具有抗菌和癒伤效果，其所做成的薄膜敷料可加速伤口癒合。而最近的实验还发现，把灵芝敷料微米化做成悬敷液，滴在兔子受损的角膜，也有加速修复角膜修的作用。此研究成果再度赋予SACCHACHITIN新的应用方向，希望未来能广泛应用於临床上。

文．图／苏庆华

◎本文原载於2010年7月《健康灵芝》第49期 6～9页

角膜疾病是眼科很常见的疾病之一，其发生原因可能是创伤、溃疡或是退行性变化等，当疾病发生时，角膜会呈现不同程度的不透明、血管新生，以及黑色素细胞的沉淀，严重时可能会使眼球穿孔或失明，所以促使角膜快速癒合是避免疾病更恶化的关键。此外，角膜上皮细胞若是受损时会引起慢性炎症、慢性溃疡，而其他疾病所造成的基质功能异常，也会影响上皮细胞的增生与附着。

目前对角膜疾病的治疗有许多方法，但也都各有缺点

在内科治疗中，疾病初期给予1% atropine能减轻睫状体痉挛与疼痛，但这也只是治标性的减轻痛苦；如果使用上皮生长因子（epidermal growth factor; EGF）持续性治疗可减缓角膜缺损症状（persistent corneal epithelial defect），但因EGF仍有其他副作用之可能，故目前仅限於动物试验阶段，尚未普及。

治疗期间使用抗生素能预防二次性细菌感染，不过抗生素会抑制上皮细胞分裂（poliferation）和移行（migration），反而阻碍角膜组织修复。如果使用较安全之维生素Ａ，确实能够促进角膜和巩膜伤口的癒合，但临床使用效果不如预期。

也有利用隐形眼镜保护上皮组织之功能作为协助治疗角膜之缺损，但也有研究认为，配戴隐形眼镜时因缺氧、眼睑剪力（shearing forces）、过敏等因素易造成慢性炎症，且纤维黏蛋白（fibronectin）会自血管漏出而使细菌附着，进而增加角膜感染的危险。

此外，手术後使用含有胶原成分的隐形眼镜（collagen shields）虽可促进角膜上皮分化作用、减少基质感染及水肿，可惜其对於慢性溃疡、深层（＞0.2 mm）角膜切除与化学性伤害时无效。

当初期使用内科治疗仍无癒合迹象时，须以外科手术以刺激组织重新生长，例如：浅层角膜切割术（superficial keratotomy）及点状角膜切割术（grid or punctuate keratotomy），其缺点为需要全身麻醉，同时也需要有经验的术者与显微手术的设备，手术结果可能影响角膜曲度、产生疤痕，甚至前房穿孔。

因此，目前对角膜疾病的治疗有许多方法，但也都各有缺点。我们期望利用灵芝子实体萃取後之残渣，经过纯化再以特殊技术研磨成为微粒制成眼药水，来克服上述因为角膜创伤及发炎之问题。

以灵芝子实体萃取後残渣制成的 SACCHACHATIN 有「抗菌」和「癒伤」效果

灵芝是一种奇妙的真菌，只要给予充分的养分和适当的生长环境，它就会在几个月内长出如意般漂亮的子实体。子实体具多种成分，这些成分包括我们现已熟知的三萜、多醣……等等，其对於改善人体生理上的各项功能，也在许多科学家的研究中一再展现出来。

为了提高这些成分，无论三萜或多醣，都是经过萃取再加以浓缩取得，但就像是泡茶一样，灵芝也会剩下许多残渣。这些残渣过去并没有明显的用途，经过我们多年的研究，灵芝渣终於摆脱作只能作为有机肥料的命运，成为非常有用的皮肤创伤敷料，也可以有效的抑制青春痘丙酸菌的生长，并达到治疗效果。

这种以灵芝子实体细胞壁为主体的敷料，是由两种主要的成分构成：一种是分子量很大的多醣（Polysaccharide），另一种是几丁质（Chitin），两者之比率大约为60：40。由於两者的分子量都很大，不是水可以溶解的，所以经过纯化後会形成纯白纸浆状物，经过冷冻乾燥也会形成像滤纸样的膜，我们称之为SACCHACHATIN（Polysaccharide + Chitin）。

我们发现SACCHACHATIN对纤维母细胞和人类角质细胞具有促进增生和位移的作用，亦能抑制伤口中过度活化而阻碍皮肤再生之蛋白水解酶（matrix meteloproteinase; MMPs），进而减少组织细胞基质的过度分解与发炎现象，达到更有效之伤口癒合。

此外，SACCHACHATIN还能吸附细菌产生的蛋白水解酶，并隔绝细菌感染，达到抗细菌之特性；也可以防止蛋白水解酶过度分解生长因子，进一步刺激伤口组织分泌生长因子，使伤口环境达到平衡，加速伤口度过发炎期，进入增生重整期。

SACCHACHATIN也会促进生长因子TGF-β分泌，活化巨噬细胞、纤维母细胞和内皮细胞分泌更多细胞激素，吸引更多细胞修复组织，并帮助血管新生作用。整体而言，SACCHACHATIN在许多动物及人体上表现出优异的伤口癒合促进能力，也使我们想将它的用途拓展到角膜修复之领域来。

SACCHACHATIN里的主要成分几丁聚醣，有效修复兔子受伤的角膜

因此我们思考如要进入此一领域，需要甚麽实验来证明。首先，SACCHACHATIN因为不溶於水中，需要研磨到很细微才能做为眼药水，否则粒子太粗不但无法达成创伤癒合效果，反而会造成更严重的伤害；其次，先要以细胞实验测试有无毒性，以及对细胞有无增殖之功能，最後须以动物模式来检验功能。

一开始我们就把SACCHACHATIN送到工研院研磨，本来希望研磨出来的粒子大小能够达到奈米级，但因为SACCHACHATIN的韧性极高，只能到达平均2.0微米，与细菌差不多大，成为半透明悬浮液，也相当程度符合我们的期望。

在细胞株上我们选了SIRC细胞株，SIRC是一种来自兔子眼睛角膜表皮细胞，常用来评估材料对於细胞增生与迁移的影响。在动物实验方面，选择的动物为纽西兰大白兔，因为兔子有美丽的大眼睛，在实验操作上比较容易，且纽西兰大白兔也相对温驯。同时也有文献显示，使用75%的酒精可制造角膜上皮适度的缺损，能有效评估对於角膜缺损癒合的效果，以期应用於临床治疗。

准备完以上材料及方法，试验就顺利展开。第一步在微粒化处理前後如［图1］，经由精密研磨後SACCHACHITIN由原先100～200μm长，缩小为只有2.45μm直径之粒子，粒径之大小除了用扫描式电子显微镜观察外，也经过粒径分析仪确认。

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【图1】SACCHACHITIN经过微粒化处理前後粒子大小之改变：

左图为处理前显示清楚的灵芝子实体菌丝；

右图经过微粒化後菌丝型态已经消失，

互相堆叠成为不规则糊状物。（比例尺为2.0μm）

经过微粒化之SACCHACHITIN可以做成不同浓度看起来半透明的悬浮液，在经过一连串测试後我们发现，浓度大约在0.1%以上时对SIRC细胞株增殖有最好的效果［图2］，以後我们就以250 μg/ml这个浓度进行其他实验。

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【图2】左图显示不同浓度之SACCHACHITIN对SIRC细胞株增殖之影响。

相对於对照组红色区块为微粒化之SACCHACHITIN（SCS），

蓝紫色区块是不添加之对照组。

整体而言，SACCHACHITIN具有最好之效果。

右图为SIRC细胞株之外观。

在证明微粒化之SACCHACHITIN对兔子角膜SIRC细胞株具有良好的增生效果後，另外又再进行一组实验，观察SACCHACHITIN是否会对SIRC细胞株之移行（Migration）也有帮助。方法就是先让SIRC细胞株在培养皿中长满，用一定大小之刮勺去除中间的细胞，再加入250μg/ml微粒化之SACCHACHITIN，并於24小时後观察刮除之部分有无细胞移行进来，结果如［图3］。

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【图3】左图为细胞进行刮除後所留下没有细胞之中间部位（0小时）；

中图为对照组，不添加任何物质，只更换培养基（24小时後）；

右图为实验组，除更换培养基外，

也添加250 μg/ml微粒化之SACCHACHITIN（24小时後）。

因此，细胞试验证实微粒化之SACCHACHITIN对兔子角膜SIRC细胞株，具有良好的增生和移行效果後，接下来就要以动物实验模式来进一步说明，SACCHACHITIN对活体也有同样之效果。此外，选好纽西兰大白兔後，也要养到一定大小（6周龄，2.5 kg）才能进行实验。

试验的方法就是先麻醉白兔，在其左眼角膜中心放置浸润75%酒精之滤纸片（7 mm直径），处理30秒後取出滤纸片，再用大量的生理食盐水以较慢的流速冲洗，造成角膜上皮损伤；右眼则不加以处理作为对照组。其後，每天对兔子眼睛点眼药水，一种是生理食盐水，另一种则为250 μg/ml微粒化之SACCHACHITIN。

将眼角膜受伤後的大白兔，於第0、6、24、48、72、96小时，分别进行两种检测：(1)用萤光试剂将角膜染色，并拍照记录其伤口面积，然後再用PIA影像分析计测软体，计算其伤口面积大小之变化。(2)取下眼角膜浸泡於10%的福马林固定保存，并做成切片观察。萤光剂可染出受损之角膜部位，这也是眼科常用之方法［图4］，至於切片则能直接观察角膜受损恢复的状况［图5］。

首先，我们观察萤光剂角膜染色之结果，经75%酒精处理後，的确在兔子眼睛造成伤害，由绿色萤光呈现其损伤部位，随後因自我恢复至96小时仍有部分损伤尚未复原；如经微粒化之SACCHACHITIN眼药水处理，则在48～72小时内已完全复原。

同样的结果也显示在角膜切片的观察中，在96小时生理食盐水这一组，虽然已没有或很少萤光呈现，却只有薄薄一层细胞再生；在同一时间点，SACCHACHITIN不仅加速伤口癒合，也迅速将角膜恢复到正常3～5层细胞之阶段，这也是萤光剂无法看到的结果。

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【图4】以75%酒精造成兔子眼睛伤害後，角膜受损後不同时间观察恢复状况。

上图为控制组，每日仅给予生理食盐水点用；

下图为实验组，每日点微粒化之SACCHACHITIN。

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【图5】左图为正常兔子角膜之切片，显示3～5层完整的上皮细胞。

中图为酒精处理造成的上皮细胞缺损，经96小时後仍只有一层细胞再生。

右图则显示以微粒化之SACCHACHITIN当作眼药水，

在96小时已恢复到与正常角膜一致之程度。

结语：期待SACCHACHATIN修复角膜的临床应用

将灵芝做很彻底的利用一直是我们实验室努力的目标， SACCHACHITIN经过十几年的开发及研究，对伤口癒合之机转已经逐渐清楚，本文对SACCHACHITIN再度赋予新的应用方向，希望能够广泛的於临床上使用。